химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

да

Х1=(Ео-Х,)(А0-Х1)4А!

и

X,2- [Ео+А0+ (1/4) k] Х,+Е0Ао=0.

Один из корней этого квадратного уравнения является концентрацией комплекса ЕАЬ другой не удовлетворяет условиям эксперимента. Полученная величина Хь однако, не является истинным значением fEAi], так как образовавшийся комплекс EAi вступает в реакцию со второй молекулой лиганда:

EAi+A^EA2.

Обозначим [ЕА]2=Х2, тогда

Х2

(X, - Ха) А

= (32/2) к.

Учитывая, что А0^>Е0 и ошибка эксперимента находится в пределах 10%, величину равновесной концентрации свободного лиганда А можно приравнять Ао. Решая данное уравнение относительно Х2, определяем концентрацию образовавшегося комплекса ЕА2. Теперь можно определить реальную концентрацию комплекса EAt:

[EAh^-Xs.

X,

В общем виде

ЕА + А:?ЕА2 (3/2) к

(Xt_X2) Ха (Х!-Ха)А

Хя

ЕА2 +А^:ЕА3 (2/3)й = (Х2-Х3) Х3 (Х2-Х3)А

ЕА3 +А^:ЕА4 (l/4)Jfe = ^ .

(Х3-Х4) Х4 (Х3-Х4)А

Реальные концентрации комплексов равны:

ЕА1=Х1—-Х2; ЕА2 = Х2—Х3; ЕА3 = Х3— Х4; ЕА4=Х4;

о~1 ЕАТаким образом, в результате проведенного анализа определяют концентрации комплексов белка с лигандом, имеющих разную степень насыщения.

Определение концентрации субъединиц, одновременно занятых двумя лигандами, которые не влияют на связывание друг друга с белком.

В предыдущем подразделе было описано взаимодействие лиганда с тетрамерным белком в равновесной системе (с. 344), при котором существует определенное распределение комплексов ЕА. Добавление к системе лиганда В приводит к усложнению ситуации и требует описания взаимодействия его с комплексами ЕАЬ ЕА2, ЕАз и ЕА4. Анализ связывания второго лиганда в таких условиях основывается на следующих предпосылках, которые выполняются в случае взаимодействия ЛДГ с аурамином О и с НАД: 1) все участки связывания аурамина О идентичны и независимы друг от друга; 2) все активные центры ЛДГ идентично и независимо связывают НАД; 3) взаимодействие ЛДГ с аурамином О не влияет на связывание НАД и наоборот.

В этом случае одновременное распределение обоих лигандов А и В по субъединицам белка можно представить в том виде, как это показано на рис. 46 для связывания НАД с комплексом ЕАЬ

менного присутствия А и В в одной субъединице различна для комплексов ЕАг с разной степенью насыщения. Ее величины приведены в табл. 3.

Таблица 3

ЕА, ЕА, ЕА, ЕА4

1/4 1/2 3/4 1

ЕВ2 1/4 1/2 3/4 1

ЕВ3 1/4 1/2 3/4 1

ЕВ4 1/4 1/2 3/4 1

Для определения концентрации субъединиц, одновременно занятых обоими лигандами, вначале отдельно рассчитывают концентрации ЕАг и ЕВ/ так, как это описано в предыдущем подразделе, используя заданные значения Ео, А0, В0 и определенные в эксперименте величины kA и &в (#в — микроскопическая константа ассоциации комплекса ЛДГ—НАД). Далее определяют долю каждого комплекса ЕАг в общей популяции форм ЛДГ как [ЕА]г/Е0. Умножая долю комплекса ЕА: на соответствующие вероятности связывания второго лиганда В в той же субъединице этого комплекса и на концентрацию комплексов ЕВЬ ЕВ2; ЕВ3 и ЕВ4, рассчитывают концентрацию субъединиц молекулы ЛДГ, одновременно занятых лигандами А и В (обозначена как [ЕАВ]):

[ЕАВ] = ([ЕВЬ + 2 [ЕВ]2 + 3 [ЕВ]3 + 4 [ЕВ]4) X

0,25 [ЕАЬ + 0,5 [ЕА]а + 0,75 [ЕА], + [ЕАЬ

IE] ИЛИ

[ЕАВН^Щ.^ЕА],.-^.

Концентрацию субъединиц, занятых только лигандом В ([ЕВ]), определяют как

[ЕВ]=? [ЕВ],-[ЕАВ].

(=1

Передаются ли в молекуле ЛДГ конформационные изменения, вызываемые связыванием НАД в активном центре одной субъединицы, на другую субъединицу?

Для ответа на поставленный вопрос проводится титрование комплекса ЛДГ с аурамином О нарастающими концентрациями НАД. Проба содержит апо-ЛДГ и аурамин О в конечных концентрациях 45 мкМ и 0,15 мМ соответственно. Регистрируют интенсивность флуоресценции пробы, после чего добавляют нарастающие концентрации НАД до конечной концентрации 6 мМ. Эксперименты проводят в 0,1 М К-фосфатном буфере (рН 7,0), содержащем 5 мМ ЭДТА, при 20 °С. Кюветное отделение термостатируют. Длина волны возбуждения — 480 нм, интенсивность флуоресценции измеряют при 517 нм. В качестве контроля используют пробу, в которой к тем же концентрациям ЛДГ и аурамина О добавляют буфер вместо раствора НАД. Таким образом получают экспериментальную кривую зависимости флуоресценции от концентрации НАД.

С помощью ЭВМ, используя программу, приведенную на с. 350, проводят теоретический расчет концентрации субъединиц ЛДГ, занятых одновременно аурамином О и НАД, и субъединиц, занятых только НАД. При расчете необходимо учитывать, что внесение НАД в пробу приводит к некоторому изменению концентраций ЛДГ и аурамина О, т. е. значения [Е]0 и i[A]0 в начале и в конце кривой титрования различны. Подобная постановка эксперимента позволяет полу-ч 1ть качественную разницу между двумя рассчитанными кривыми. Зависимость концентрации субъединиц, занятых только НАД, от его концентрации представляет собой обычную кривую насыщения. Концентрация субъединиц, несущих одновременно оба лиганда, зависит от количества добавленного НАД более сложным образом.

страница 175
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
циан купить участок на новой риге
моноколесо airwheel q3
starline купить брелок
тепловентиляторы кэв-6с41е

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(25.04.2017)