химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

мента, увеличение интенсивности флуоресценции зонда при связывании НАД с апо-ЛДГ объясняют изменениями структуры аураминсвязывающих областей молекулы белка в результате изменения состояния активного центра.

Определение прочности связывания кофермента (НАД) по флуоресценции комплекса ЛДГ с аурамином О

Взаимодействие НАД с ЛДГ достаточно трудно изучать обычными спектральными методами. Увеличение флуоресценции связанного с ЛДГ зонда под действием НАД позволяет определить значение k для кофермента в комплексе ЛДГ - НАД — аурамин О по изменениям эмиссии последнего. Для этого регистрируют флуоресценцию пробы, содержащей 0,03 мМ апо-ЛДГ и 0,15 мМ аурамин О, после чего титруют данный комплекс раствором НАД до его конечной концентрации 2,5 мМ. Ставят контроль, в котором учитывают влияние использованных концентраций НАД на флуоресценцию той же концентрации свободного зонда. В полученной кривой титрования прирост флуоресценции пропорционален концентрации связывающегося кофермента.

Анализ полученных результатов проводят по методу, предложенному Д. Холбруком. Его основой является уравнение

где L0 — общая концентрация лиганда, в данном случае НАД; Е0 — концентрация участков связывания лиганда, в данном случае концентрация активных центров ЛДГ; к — константа диссоциации комплекса НАД—ЛДГ в присутствии аурамина О; а — степень насыщения активных центров коферментом.

Значения а находят из отношения ДФ/ДФщах, где ДФтах — изменение флуоресценции связанного зонда при насыщающей концентрации НАД, АФ — изменение флуоресценции при данной концентрации НАД. При графическом представлении данных по оси абсцисс откладывают L0/a, по оси ординат — 1/(1—а). Величину k находят как котангенс угла наклона полученной прямой. Определенное значение k сравнивают со значениями этой величины, известными из литературы и равными 0,5 мМ. Аналогичным образом может быть определено значение k для комплексов пирувата и АДФ с ЛДГ по их влиянию на флуоресценцию связанного с ЛДГ аурамина О.

Равновесное связывание лигандов с олигомерным белком

В этой части работы проводится теоретический анализ взаимодействия одного и двух лигандов с молекулой белка, имеющей четыре идентичных и независимых центра связывания для каждого из лиган-дов, в качестве которых в работе выступают аурамин О и НАД.

Связывание одного лиганда. При заданных значениях Е0 и А0 в пробе одновременно присутствуют комплексы белка с лигандом с различной степенью насыщения (т. е. ЕАЬ ЕА2, ЕА3 и ЕА4), а также свободный белок в равновесной концентрации Е. Определение их концентрации и является целью дальнейшего анализа.

Участки связывания характеризуются одинаковыми величинами микроскопической константы ассоциации комплекса белок — лиганд. Таким образом, для первой молекулы лиганда существует равная вероятность взаимодействия с любым из центров связывания (на рис. 45 макромолекула схематически изображена в виде квадрата с четырьмя

А

Рис. 45. Равновесное связывание молекулы лиганда с тетрамерной молекулой белка

центрами связывания). В результате возникает набор микроскопических форм ЕАь Каждая из них при этом представлена в равных количествах. Комплекс ЕАг представлен шестью подобными микроскопическими формами, комплекс ЕА3 — четырьмя, комплекс ЕА4 — одной.

Концентрацию комплекса ЕА; можно выразить через концентрацию любой другой формы:

[ЕА],.=-[ЕА1'-'1Д1 ,

где Kt — макроскопическая константа, которая включает весь набор форм, обозначенных ЕАг и EAЈ-i.

Для К\ соотношение макро- и микроскопической констант выглядит следующим образом:

А

= 4k.

[Е] • [А]

Соответственно для второй, третьей и четвертой молекул лиганда можно вывести соотношение между макро- и микроскопическими константами ассоциации данных комплексов:

K2=(W)K Ks=(2!3)k, K^(l/4)k.

Концентрации комплексов макромолекулы с различной степенью насыщения лигандом можно получить, подставляя приведенные значения констант ассоциации в уравнение закона действующих масс:

[ЕА]2 fEA]3 [ЕА]4 В общем виде

lEAh =К1 [Е] [А] = 4k [Е] [А],

KJEA]X [А] ^(З^ЦЕА], [А] = 6&2 [Е] [AJ2,

К3[ЕА]2 [А]=(2/3)А[ЕА]8 [А] = 4^3 [Е] [А]»,

К4[ЕА]з![А]=(1/4)^[ЕА]3 [А] = **[Е] [А]*.

N — i + 1

И

[ЕА], = р5А],N — i + 1

) k [А],

где К — макроскопическая константа ассоциации; k — микроскопическая константа ассоциации, определенная экспериментально, как изложено выше; [А] — равновесная концентрация свободного лиганда; [EA]t — концентрация i'-комплекса ЕА; N — количество участков взаимодействия лиганда с белком, известное из предыдущих экспериментов.

Анализ такой системы позволяет определить концентрации комплексов EAi, ЕА2, ЕА3, ЕА4 и равновесную концентрацию свободного белка Е в пробе при заданных значениях Е0 и А0. Известными величинами являются Е0 и А0, что достаточно для решения системы уравнений, описывающих процесс связывания.

Расчет проводится по следующей схеме.

В результате первого акта связывания образуется некоторая концентрация комплекса ЕАь

Е+А^ЕАь [ЕА] 1=[Е] [А]4*.

Обозначим EA!=Xi, тог

страница 174
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
электросамокат airwheel
Волховец Анегри какао купить
аренда звукового оборудования
трезвый водитель дешево

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(27.06.2017)