химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

ения; Ф — измеренная интенсивность флуоресценции; Ф0=Дф — исправленная величина интенсивности флуоресценции, используемая в работе.

тбета

держатель

Isill

tp/гуоресценция

Рис. 44. Определение параметров кюветно-го отделения для учета эффекта внутреннего фильтра

Наблюдаемое увеличение флуоресценции зонда в присутствии белка отражает связывание аурамина О с ЛДГ, т. е.

АФ=К-[аурамин 0]св. (2)

Для количественного анализа взаимодействия проводят другой эксперимент, в котором определяют максимальный прирост интенсивности флуоресценции зонда при его полном связывании с белком. При этом постоянную низкую концентрацию аурамина О (которую выбирают таким образом, чтобы можно было зарегистрировать флуоресценцию зонда в буфере) титруют нарастающими количествами фермента. Строят график двойных обратных величин и проводят экстраполяцию к бесконечной концентрации белка. Таким образом устанавливают значение интенсивности флуоресценции данной концентрации зонда при его полном связывании с ЛДГ. Соотношение полученной величины с флуоресценцией данной концентрации зонда в буфере показывает, во сколько раз увеличивается флуоресценция аурамина О при связывании. Используют несколько концентраций аурамина О для титрования белком, что повышает точность определения величины прироста флуоресценции (ФШах). В этих экспериментах

Фтах=К-[аурамин 0]Св,

2 Так как используемые значения Фтах и ДФ не являются относительными величинами, следует определять их при одной и той же чувствительности прибора, либо переходить к относительным величинам.

причем концентрация связанного зонда равна его общей концентрации в растворе. Отсюда можно определить значение коэффициента К. Подставляя это значение в уравнение (2), предварительно определив величины ЛФ, можно рассчитать концентрацию связанного аурамина О в каждой точке кривой титрования фермента зондом2. Так как общая концентрация аурамина О известна, равновесная концентрация свободного зонда легко может быть вычислена.

Полученные данные используют для определения типа связывания, количества участков связывания аурамина О на молекуле белка и величины Кд комплекса белка с зондом.

Равновесное взаимодействие молекулы белка (Е) с лигандом (А) аюжно представить так:

ЕАХ +А^:ЕА2;

ЕАдг_1 + А EAN Такой процесс описывается уравнением

[Е]„ _ 1

[А]св N

\ IAJcbo6 /

= 1 +

где [Е]0 — общая концентрация фермента. Для анализа это уравнение обычно используют в форме, предложенной Скэтчардом:

v N 1 /о\

v, (3)

[A] k к

где -v — количество молей лиганда, связанных с молем белка (\~ у, k — микроскопическая константа диссоциации; А — концентрация свободного лиганда.

Данные, полученные в эксперименте, представляют в виде графика Скэтчарда, откладывая по оси абсцисс значения % а по оси ординат — v/[A]. При связывании лиганда в равноценных и невзаимодействующих участках экспериментальные точки образуют прямую, экстраполяция которой на ось абсцисс дает значение N, а наклон равен ~1/&3.

Нативный препарат ЛДГ дает обычно около 4 независимых участков связывания аурамина О и значение k, близкое к 1 -10—4 М.

Влияние состояния активного центра ЛДГ на флуоресценцию связанного аурамина О

3 График, имеющий вид вогнутой кривой, может быть обусловлен либо отрицательной кооперативностью связывания лиганда, либо существованием на макромолекуле участков связывания с различными константами диссоциации. В случае положительной кооперативности при связывании лиганда график имеет вид выпуклой кривой.

Изучают влияние НАД, пирувата и АДФ на флуоресценцию аурамина О, связанного с ЛДГ. Для этого вначале снимают спектр флуоресценции раствора, содержащего 0,04 мМ апо-ЛДГ и 0,15 мМ аурамина О в 0,1 М К-фосфатном буфере (рН 7,0), содержащем 5 мМ ЭДТА, а затем добавляют к пробе лиганды в следующих конечных концентрациях: 6 мМ НАД, 6 мМ пируват, 9 мМ АДФ. Регистрируют увеличение флуоресценции комплекса аурамина О с ЛДГ под действием использованных соединений. Ставят контроль, в котором учитывают влияние добавок на флуоресценцию зонда в отсутствие белка. Рост интенсивности эмиссии связанного с белком аурамина О может быть обусловлен либо увеличением его количества, либо изменением флуоресцентных характеристик зонда. В любом случае увеличение флуоресценции зонда при связывании лигандов в активном центре свидетельствует о конформационной перестройке участков молекулы белка, находящихся вне активного центра в результате взаимодействия последнего с коферментом, субстратом и ингибитором.

Чтобы сделать выбор между двумя возможными объяснениями эффекта, определяют концентрацию НАД, необходимую для получения холоформы ЛДГ, добавляя к комплексу апо-ЛДГ с зондом (с. 340) НАД до тех пор, пока флуоресценция аурамина О не перестанет увеличиваться. Затем в отдельной пробе титруют холо-ЛДГ аурамином О (так же, как апо-ЛДГ); определяют число участков и величину к для комплекса аурамина О с холо-ЛДГ. В случае совпадения полученных значений с величинами, определенными для апофер

страница 173
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
где купить металлический штакетник и цена
интерьер кинотеатра дома
проекторы на лобовое стекло отзывы
стол olivia

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(04.12.2016)