химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

ерментов//Ферменты. М.^ 1983. Т. 1.

С. 82.

6. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики. М., 1979.

7. Eventoff W. et al. Structural adaptation of lactate dehydrogenase isoenzymes// //Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1977. Vol. 74, N 7. P. 2677.

4. ИЗУЧЕНИЕ КОНФОРМАЦИОННЫХ ИЗМЕНЕНИЙ ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ПРИ СВЯЗЫВАНИИ КОФЕРМЕНТА И СУБСТРАТА

Для решения различных вопросов, встающих при исследовании структуры и функции ферментов, часто используется подход, связанный с введением в активный центр фермента аналогов кофермента, субстрата или ингибиторов реакции. В то же время в ряде случаев необходимо, чтобы активный центр мог свободно взаимодействовать с участниками реакции и ее ингибиторами. Информация о связывании лигандов в активном центре в этом случае может быть получена из других областей молекулы белка, чувствительных к состоянию активного центра.

+

При изучении изозима М4 лактатдегидрогеназы (ЛДГ) из мышц свиньи связывание НАД, пирувата и других соединений в активном центре фермента можно наблюдать с помощью флуоресцентного ка-тионного зонда аурамина О, структура которого приведена на рисунке:

HNH

Молекула зонда равновесно присоединяется к белку в участках, неперекрывающихся с активными центрами. Флуоресцентные характеристики связанного аурамина О чувствительны к состоянию последнего. К изменению флуоресценции аурамина О ведет перестройка белкового окружения молекулы связанного зонда, возникающая под действием связавшихся в активном центре НАД, пирувата или аденило-вых нуклеотидов. Другими словами, между активным центром ЛДГ и аураминсвязывающим участком белка существует конформационная взаимосвязь.

Цель первой части работы — обнаружение на молекуле ЛДГ участков, способных к взаимодействию с аурамином О; демонстрация чувствительности флуоресцентных характеристик связанного аурамина О к взаимодействию ЛДГ с коферментом, субстратом и ингибитором реакции; определение значения константы диссоциации (/Сд) комплекса НАД—ЛДГ по флуоресценции аурамина О.

Во второй части работы предлагается выяснить, определяются ли конформационные изменения аураминсвязывающего участка состоянием активного центра той субъединицы, на которой находится этот участок, или конформационная взаимосвязь существует между активным центром одной субъединицы и аураминсвязывающим участком другой. Для решения этого вопроса проводится теоретический анализ шйимидеинвия олигомерного оелка с двумя лигандами в равновесной системе. В данном случае один из них — НАД, другой — аура-мин О. По результатам анализа строятся графики зависимости концентрации субъединиц белка, находящихся в комплексе с обоими лигандами одновременно или только с НАД, от количества добавленного в систему НАД. Экспериментально определяется зависимость изменений флуоресценции аурамина О при титровании коферментом комплекса ЛДГ — зонд. Сравнивая полученную в эксперименте кривую с рассчитанными теоретически, можно дать ответ на поставленный вопрос.

Реактивы:

1. Лактатдегидрогеназа из мышц свиньи — коммерческий препарат фирмы «Reanal» (препарат трижды перекристаллизовывают путем добавления насыщенного раствора сульфата аммония (рН 7,0) к

раствору белка до помутнения. Очищенный таким образом препарат

является апоферментом М4).

2. Аурамин О — перекристаллизовывают из воды в присутствии 20 мМ NaCl при 30 °С.

3. К-фосфатный буфер — 0,1 М раствор, рН 7,0, содержащий 5 мМ ЭДТА.

4. Аурамин О — 1,5 мМ раствор.

5. НАД - 120 мМ раствор.

6. Пируват натрия — 120 мМ раствор.

7. АДФ - 180 мМ раствор.

Характеристика связывания аурамина О с апоформой ЛДГ

Флуориметрические исследования проводят на спектрофлуоримет-ре в кювете, имеющей четыре прозрачные грани. Интенсивность флуоресценции регистрируют при 517 нм под прямым углом к возбуждающему свету, используя длину волны возбуждения 480 нм. Кюветное отделение термостатируют при 20 °С.

Все измерения ведут в 0,1 М К-фосфатном буфере, содержащем 5 мМ ЭДТА, рН 7,0. Апо-ЛДГ предварительно обессоливают на колонке с сефадексом G-50, уравновешенной тем же буфером. Концентрацию белка определяют спектрофотометрически, используя ЛГш при 280 нм=14 (м. м.= 140 000 Да).

Раствор аурамина О готовят на том же буфере, используя коэффициент молярной экстинкции, равный 4,4Ы04 М-1 см-1 при 430 нм. Титрование ЛДГ аурамином О проводят непосредственно во флуори-метрической кювете, добавляя к раствору белка конечной концентрации 4,4-Ю-5 М раствор аурамина О так, чтобы его конечные концентрации менялись от МО-5 М до 2,5-Ю-4 М. В качестве контроля снимают флуоресценцию тех же концентраций аурамина О в отсутствие белка Значения интенсивности флуоресценции исправляют на флуоресценцию свободного зонда и на разведение белка при добавлении аурамина О (следует использовать минимальные объемы раствора красителя). Учитывают влияние эффекта внутреннего фильтра по формуле:

Ф0 _ 2,3-А(дя —

ф ю~А а> _ Ю_А аг '

где а{ и а2 — параметры кюветного отделения (рис. 44); А — оптичеекая плотность образца при длине волны возбужд

страница 172
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
ускоренные компьюторные курсы в москве,цены
КНС Нева рекомендует асус игровой ноутбук - в кредит не выходя из дома в Санкт-Петербруге, Пскове, Мурманске и других городах северо-запада России!
покраска и выпрямление двери
моноколесо onewheel м15 music купить

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(03.12.2016)