химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

для тестирования дегидро-геназных реакций, протекающих с участием НАД или НАДФ. В основе тетразолиевого метода лежит образование нерастворимых хромоген-ных веществ — формазанов. Схематически образование формазанов может быть представлено следующей последовательностью реакций:

НАДФН ^ ФеназинметосУльФаток -** феназинметосульфатвосст.

ФеназинметосульфатВ0сст + нитросиний тетразолий ->->-нитросиний тетразолийвосСт (диформазан, окрашенный продукт).

Из представленной схемы видно, что образующиеся в процессе ферментативной реакции восстановленные НАД и НАДФ не реагируют непосредственно с нитросиним тетразолием, в связи с чем в реакционную смесь включают промежуточный переносчик электронов между восстановленными никотинамидными коферментами и солями тет-разолия, причем наиболее часто для этой цели используют феназин-метосульфат

Применяя тетразолиевый метод, следует иметь в виду, что иногда образование формазанов в результате восстановления нитросинего тет-разолия наблюдается не только за счет восстановленных никотинамид-ных коферментов, но и за счет неспецифических восстановителей.

Известно, что степень неспецифического восстановления тетразо-лиевых солей возрастает с увеличением рН среды инкубации, а при рН 9—10 образование окрашенных продуктов может идти самопроизвольно.

При изучении изозимного состава ферментов в тканевых экстрактах или в суспензиях субклеточных фракций, представляющих собой сложную смесь многих ферментов, необходимо ставить соответствующие контрольные пробы, в которых из инкубационной смеси, используемой для проявления активности определенных ферментов, исключаются субстраты.

При анализе полученных результатов путем сравнения зон окрашивания в контрольных и опытных столбиках геля выделяют полосы, специфичные для изучаемого фермента.

Результаты по изучению изозимного состава ферментов представляют в виде схем или фотографий, а также в виде денситограмм, полученных путем сканирования проявленных на активность гелей в денситометре.

Состав реакционной смеси для проявления активности лактатдегидрогеназы в полиакриламидном геле: К-фосфатный буфер 100 мМ, рН 7,4; лактат натрия 100 мМ; НАД 0,5 мМ; феназинметосульфат 40 мкг/мл; тетразолий нитросиний 400 мкг/мл.

Реакционную смесь готовят непосредственно перед определением активности Инкубацию гелей проводят в темноте при температуре 37° С или при комнатной температуре в течение различных промежутков времени (10—60 мин). Оптимальным считается временной интервал, в течение которого происходит максимально полное выявление всех изозимов фермента. При этом не должна иметь место диффузия восстановленного тетразолия из специфических зон в свободные от лактатдегидрогеназы области геля. После проявления гелей на специфическую активность их фиксируют в 7%-ной уксусной кислоте

Изучение свойств изозимов лактатдегидрогеназы

1. Определяют активность лактатдегидрогеназы в растворимой клеточной фракции скелетной и сердечной мышц крысы в день выделения и после хранения препарата при —5° С.

2. Исследуют изозимный состав лактатдегидрогеназы в гиало-плазме сердечной и скелетной мышц крысы методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле.

3. Изучают термостабильность лактатдегидрогеназы из разных источников, нагревая фермент (растворимая клеточная фракция) при 60°С в течение 10, 20, 30 мин. Оценивают защитный эффект 0,5 мМ НАДН от термоинактивации. С целью учета стабилизирующего влияния на лактатдегидрогеназу других белков цитозоля в качестве объекта исследования используют растворимую клеточную фракцию в разведении 1 : 7 и 1 : 200.

4 Исследуют зависимость скорости лактатдегидрогеназной реакции от концентрации пирувата натрия в диапазоне концентраций субстрата 0,02—2,5 мМ. Для разных препаратов фермента с помощью графических методов определяют значение Km по пирувату.

Исследуют явление субстратного торможения реакции при высоких концентрациях пирувата вследствие образования непродуктивного тройного комплекса фермент — пируват — НАД. С этой целью ферментный препарат инкубируют в течение 10 мин в присутствии пирувата и 150 мкМ НАД при комнатной температуре. Реакцию начинают добавлением НАДН.

5 Изучают ингибирующее влияние оксалата натрия на лактатдегидрогеназу из разных источников. С этой целью исследуют зависимость скорости реакции от концентрации пирувата натрия: 0,02— 0,15 мМ — для фермента, выделенного из сердечной мышцы, и 0,06— 0,5 мМ — для фермента из скелетной мышцы в присутствии различных концентраций ингибитора: 0,1 — 1 мМ. Полученные данные обрабатывают в координатах Лайнуивера—Барка и Диксона Определяют тип ингибирования различных препаратов лактатдегидрогеназы оксалатом, рассчитывают значения Kt по оксалату в отношении пирувата натрия.

ЛИТЕРАТУРА t

1. Диксон М., Уэбб Э. Биология ферментов//Ферменты. М., 1983. Т. 3. С. 887.

2. Райдер К, Тейлор К. Изоферменты. М., 1983.

3. Яковлева В. И. Изоферменты//Усп. биол. хим. 1968. Т. 9. С. 55.

4. Уилкинсон Дж. Изоферменты. М., 1968.

5. Диксон М., Уэбб Э. Кинетика действия ф

страница 171
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
виниловый сайдинг под блок хаус купить в г. дмитров
кресло ch 599
dse maxi блок отопления
кресло-качалка складное

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(07.12.2016)