химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

//J. Biol. Chem. 1973. Vol. 248, N 11. P. 3963.

3. ИЗУЧЕНИЕ ИЗОФЕРМЕНТНОГО СОСТАВА ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ СЕРДЕЧНОЙ И СКЕЛЕТНОЙ МЫШЦ

Лактатдегидрогеназа — фермент гликолитической цепи обмена углеводов, катализирующий обратимую реакцию превращения пировиноградной кислоты в молочную с участием восстановленной и окисленной форм НАД (с. 273). В большинстве тканей млекопитающих лактатдегидрогеназа (ЛДГ) представляет собой тетрамер, образованный различным сочетанием двух типов субъединиц — М и Н, синтез которых контролируется двумя независимыми генными локусами. Из двух различных субъединиц в тканях формируются 5 изозимов лактатдегидрогеназы: Н4, Н3МЬ Н2М2, Н^з, М4 (в другом обозначении ЛДГЬ ЛДГ2, ЛДГ3, ЛДГ4, ЛДГ5, где ЛДП и ЛДГ5 - изозимы с соответственно максимальной и минимальной электрофоретической подвижностью). Для множественных форм фермента * характерна достаточно выраженная органная специфичность. Так, изозимы лактатдегидрогеназы с высоким содержанием М-субъединицы широко представлены в мышечной ткани и в печени, обогащенные Н-субъединицей изозимы распространены в сердечной мышце и в мозге. Особенности первичной структуры боковых цепей и области активного центра М-и Н-субъединиц составляют основу для существенных различий в проявлении физико-химических и кинетических свойств изозимии. ±ичнис знание изозимного состава фермента принципиально важно при моделировании метаболических путей как в условиях физиологической нормы, так и при различных патологических состояниях.

Цель работы — изучение структурных и функциональных свойств изозимов лактатдегидрогеназы в сердечной и скелетной мышцах крысы, являющихся критериями при установлении изозимного состава фермента в ткани.

Реактивы:

1. К-фосфатный буфер — 100 мМ раствор, рН 7,4.

2. Пируват натрия — 45 мМ раствор.

3. НАДН — 3 мМ раствор (свежеприготовленный).

4. Лактат натрия — 1 М. раствор.

5. НАД — 10 мМ раствор.

6. Реактивы для электрофоретического исследования кислых белков в полиакриламидном геле.

7. Тетразолий нитросиний.

8. Феназинметосульфат.

9. Оксалат натрия — 30 мМ раствор.

Получение растворимой клеточной фракции скелетной и сердечной мышц крысы

Все процедуры по получению клеточных фракций проводят при

0°С.

Среда выделения: 100 мМ К-фосфатный буфер, рН 7,4.

Навеску мышечной кашицы массой ~2—5 г (получение см. на с. 49) гомогенизируют в стеклянном гомогенизаторе Поттера с теф-лоновым пестиком, имеющим нарезку, в 6-кратном по отношению ,к весу ткани объеме среды выделения. Тканевый гомогенат центрифугируют при 15000 g в течение 20 мин. Супернатант, представляющий собой 14%-ную растворимую клеточную фракцию, фильтруют через 4 слоя марли и хранят порциями при —5°С в течение 2 нед. Размораживание растворимой клеточной фракции проводят при комнатной температуре. Перед определением активности лактатдегидрогеназы препарат разводят средой выделения до конечного разведения 1:200.

Получение гиалоплазмы. Тканевый гомогенат сердечной и скелетной мышц центрифугируют при 100 000 g в течение часа. Полученный супернатант представляет собой 14%-ную гиалоплазму. Препарат фильтруют через 4 слоя марли и разводят электродным буфером (с. 94) до конечного разведения 1 :200.

Определение активности лактатдегидрогеназы проводят спектро-фотометрическим методом в ходе восстановления пировиноградной кислоты за счет окисления НАДН (с. 7). За ходом реакции следят по падению оптической плотности при 340 нм. Показания прибора регистрируют каждые 15 с в течение 2 мин.

Состав реакционной среды объемом S мл: 100 мМ К-фосфатный буфер, рН 7,4; пируват натрия 1,5 мМ — для фермента скелетных мышц и 0,75 мМ. — для фермента сердечной мышцы; НАДН — 0,1 MMV Контрольная проба не содержит пируват натрия. Реакцию начинают добавлением ферментного препарата (20—100 мкл препарата).

Расчет активности фермента проводят на основании величин начальной скорости реакции при условии наличия прямой пропорциональной зависимости скорости от количества ферментного препарата в проое. АКТИВНОСТЬ фермента выражают в микромолях окисленного НАДН за 1 мин на 1 г ткани.

Исследование электрофоретической подвижности

лактатдегидрогеназы методом диск-электрофореза

в полиакриламидном геле (с. 94) %

Для электрофоретического исследования используют гиалоплазму сердечной и скелетной мышц крысы в разведении 1 :200. На гель наносят 50—100 мкл образца, утяжеленного равным объемом 40%-ной сахарозы. Камеру для электрофореза помещают в холодильник и проводят электрофорез при начальной силе тока 2 мА на гель в течение 10 мин, а затем при 4 мА на гель в течение 1,5—2 ч (свидетель бромфеноловый синий не доходит до конца геля на 0,3 см).

После окончания процедуры электрофореза проводят идентификацию белковых зон в геле, соответствующих положению в нем изози-мов лактатдегидрогеназы. С этой целью гели инкубируют в среде для протекания обратной лактатдегидрогеназной реакции (с. 339). Образовавшийся в месте локализации фермента НАДН выявляют с помощью тетразолиевого метода, применяемого

страница 170
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
металлочерепица полиэстер цена
пункты проката гироскутеров в москве
судейская майка для хоккея купить в спб
иван-царевич и серый волк

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(21.08.2017)