химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

по отношению к весу ткани объеме среды выделения. Тканевый гомогенат центрифугируют при 15 000 g в течение 20 мин. Супернатант после центрифугирования, представляющий собой 14%-ную растворимую клеточную фракцию, фильтруют через 4 слоя марли и хранят порциями при —5°С в течение 2 нед. Размораживают при комнатной температуре и перед определением активности пируваткиназы разводят средой выделения до конечного разведения 1 :200.

Определение активности пируваткиназы. Активность фермента определяют энзиматическим методом по количеству образовавшегося в ходе реакции пирувата. Метод основан на использовании сопряженной лактатдегидрогеназной реакции (с. 270). За ходом реакции следят на спектрофотометре по уменьшению оптической плотности при 340 нм в результате окисления НАДН. Показания прибора регистрируют каждые 30 с в течение 3 мин.

Состав реакционной среды объемом 3 мл: 100 мМ трис-HCl буфер, рН 7,5; фосфоенолпируват 0,8 мМ; АДФ 3 мМ; MgCl2 6 мМ; КС1 100 мМ; НАДН 0,1 мМ; лактатдегидрогеназа 1 инт. ед.; растворимая клеточная фракция 0,02—0,1 мл. Контрольная проба не содержит Mg—АДФ. Реакцию начинают добавлением фосфоенолпирувата.

Расчет активности фермента проводят на основании величин начальной скорости реакции при условии наличия прямой пропорциональной зависимости скорости от количества ферментного препарата

НАДН за 1 мин на 1 г ткани.

Способы представления данных по исследованию кооперативных взаимодействий

1. Оценка меры неоперативности в координатах Хилла. С использованием логарифмической шкалы строят график зависимости степени проявления эффекта от концентрации эффектора, т. е.

А — а

тде а — эффект, наблюдаемый при данной концентрации эффектора; Л — максимально проявившийся эффект; [Ь] — концентрация эффектора. Тангенс угла наклона графика к оси абсцисс дает значение коэффициента Хилла [NH). ПО точке пересечения графика с осью абсдисс А —а ~ ^) можно определить величину &о,б. т. е. концентрацию эффектора, при которой достигается 50%-ный эффект.

2. Оценка меры кооперативности в координатах Силоновой— Курганова (разностный метод). Строят график зависимости обратной величины скорости реакции от lg концентрации эффектора. На графике выбирают три точки с координатами:

Для случая, когда начальная скорость реакции vQ в отсутствие эффектора, являющегося активатором, равна 0, коэффициент Хилла д рассчитывают по формуле:

lg f ( Vi v2 ) / ( v% v9 ) }

где vu v2, t>3 — скорости при концентрации эффектора b\, b2, b$.

Если эффектор является ингибитором фермента, коэффициент Хилла рассчитывают по формуле:

lg {( fo-Pf.i ~ Ъ-^.з) / ( Pb-pf,2 ~~ ^~%з)}

ч , •

Исходный график анализируют на нескольких участках, оценивают зависимость величин q от концентрации эффектора.

Изучение свойств пируваткиназы

1. Определяют активность пируваткиназы в растворимой клеточной фракции мышц в день выделения и после хранения препарата при -5°С.

2. Исследуют зависимость скорости реакции от концентрации фосфоенолпирувата в диапазоне 2-10~5—2-10~4 М и от концентрации АДФ в диапазоне 5-10~5—5-10~4 М (при этом сохраняется соотношение АДФ:М?=1:2). Исследования проводят на свежевыделенном препарате растворимой клеточной фракции,, а также на препарате, дважды подвергнутом процедуре замораживания-оттаивания. Работу проводят при различных значениях рН среды — 7,2 и 8,4. Полученные данные обрабатывают с целью оценки величин Кт или 50,5 по субстратам.

3. Исследуют зависимость скорости реакции от концентрации водородных ионов в диапазоне значений рН 7,2—8,4. В экспериментах используют 100 мМ трис-HCl буфер, перед определением "активности фермент выдерживают при данном значении рН в течение 3 мин.

4. Исследуют влияние 10 мМ фенил аланина на активность пируваткиназы в диапазоне значений рН 7,2—8,4.

5. В оптимальных (по рН) условиях действия фенилаланина анализируют зависимость скорости реакции от концентрации ингибитора 0,1 — 10 мМ в отсутствие и в присутствии в среде инкубации 5 мМ аланина. В отдельном эксперименте исследуется влияние 5 мМ аланина на активность пируваткиназы. В работе используются свежевыделен-ные препараты растворимой клеточной фракции, а также после 2-кратного размораживания. Анализируют характер ингибирующего воздействия фенилаланина на пируваткиназу, оценивая NH по эффектору.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ньюсхолм Э., Старт К- Регуляция метаболизма. М., 1977.

2. Курганов Б. И. Аллостерические ферменты. М., 1978.

3. Райдер Е., Тейлор К. Изоферменты. М., 1983.

4. Weber G. Role of key enzymes in metabolic reguIation//Mechanism of action and regulation of enzymes/Ed. T. Keleti. Budapest, 1975. Vol. 32. P. 237.

5. Phillips F., Ainswort S. Allosteric properties of rabbit muscle pyruvate kinase// //Int. J. Biochem. 1977. Vol. 8. P. 729.

6. Brown С. E., Teylor J. M, Chan L. Effect of pH on the interaction of substrates and effector to yeast and rabbit muscle pyruvate kinase//Biochim. Biophys. Acta. 1985. Vol. 829. P. 342.

7. Kenep R. G. Inhibition of muscle pyruvate kinase by creatin phosphate

страница 169
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
evrodizain
сетка сварная оцинкованная 40 40
MT 2107
пяти ступенчатый регулятор скорости канального вентилятора

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(18.01.2017)