химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

раскапывают по 50 мкл среды инкубации и помещают их в термостат на 30 °С Реакцию начинают добавлением 20 мкл соответствующих растворов протеинкиназы. (Пробы заполняют последовательно через каждые 20 или 30 с, в контрольную пробу вносят 20 мкл Н20.) Через 10 мин реакцию останавливают добавлением 20 мкл раствора Ж. Аликвоты по 50 мкл из среды инкуба-' ции наносят на бумажные фильтры. Фильтры погружают в кристаллизатор с 10%-ной трихлоруксусной кислотой на 20 мин, затем отмывают 6%-ной трихлоруксусной кислотой (4—5 раз по 20 мин). Отмывку контролируют путем периодического обсчета контрольного фильтpa ВО флаконе с 070-нои дриллирукд-уснии кислслии в чяришсиим* t\aнале. Когда счет радиоактивности в контрольном фильтре станет ниже, чем 100—200 имп/мин, отмывку прекращают, фильтры заливают ацетоном на 5—7 мин. Отмывку ацетоном проводят 2 раза. Фильтры выкладывают на фильтровальную бумагу и сушат на воздухе. Затем помещают во флаконы и заливают 5 мл сцинтиллятора ЖС-106. Счет радиоактивности определяют в «фосфорном» канале.

Удельную фосфотрансферазную активность рассчитывают по формуле:

,, нмоль

Удельная активность,

мг-мин

(счет радиоактивности в опытной пробе — счет радиоактивности в контроле)

общий счет радиоактивности в пробе X количество белка в пробе, мг

количество АТФ в пробе, нмоль х 1,3 время реакции, мин

где 1,8—пересчетный коэффициент. ЛИТЕРАТУРА

J. Гривенников И. А., Буларгина Т. В., Северин Е. С. цАМФ-зависимые

протеинкиназы. Свойства, регуляции и биологические функции//Функциональная активность ферментов и пути ее регуляции/Под ред. С. Е. Северина, Г. А. Кочетова. М., 1981. С. 30.

2. Beavo J. A., Bechtel P. J,, Krebs E. G. Preparation of homogenous cyclic AMP-dependent protein kinase and its subunits from rabbit skeletal muscle//Methods Enzymol. 1974. Vol. 38c. P. 299.

3. G i 1 m a n A. G. A protein binding assay for adenosine 3', 5'-cyclic monophosphate// //Proc. Nat. Acad. Sci. (USA). 1970. Vol. 67, N 1. P. 305.

4. Johns E. W., В u 11 e г J. A. V. Farther fractionation of histone from calf thymus// //Biochem. J. 1962. Vol. 82, N 1. P. J 5.

5. Spector T. Refinement of the copmassie blue method of protein quantitation. A symble and linear spectrophotometries assay for 0,5 to 50 U of protein//Anal. Biochem. 1978. Vol. 86, N 1. P. 142.

2. РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ПИРУВАТКИНАЗЫ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ

Пируваткиназа принадлежит к группе ферментов гликолитиче-ской цепи и катализирует практически необратимую реакцию трано -фосфорилирования между фосфоенолпируватом и Mg—АДФ с образованием пирувата и Mg—АТФ (с. 269).

Фермент является тетрамером и в тканях млекопитающих представлен тремя изоформами, среди которых наиболее распространены L-пируваткиназа, или печеночный изозим, и Л1гпируваткиназа, иначе мышечный изозим. Общепризнанным является представление о L-пи-руваткиназе печени как об одном из ключевых ферментов гликолиза. Проблема регуляторной роли Mi-пируваткиназы в контролировании гликолиза в скелетной мышце остается нерешенной. Отчасти это связано с тем, что к пируваткиназе мышечной ткани применимы не все критерии, согласно которым, по современным представлениям, фермент может выдвигаться на роль ключевого. В частности, является спорным вопрос об аллостерической природе фермента, а также о проявлении им кооперативных свойств при взаимодействии с субстратами. Возможная причина противоречий связана, по-видимому, с выраженной конформационной подвижностью Mi-изозима пируваткиназы, вследствие чего фермент утрачивает кооперативные свойства при изменении рН или ионного состава среды.

ц^лью раиоты является изучение, с помощью кинетических подходов возможности проявления пируваткиназой скелетных мышц аллостерических и кооперативных свойств по отношению к субстратам и фенилаланину. Исследования проводятся на скелетных мышцах крысы с применением десенсибилизирующих воздействий на белок: изменения рН, низкой температуры, а также многоточечного .дигандногс* связывания.

Реактивы:

1. Трис-HCl буфер — 50 мМ раствор, рН 7,5.

2. Трис-HCl буфер - 100 мл раствор, рН 7,2-8,4.

3. Фосфоенолпируват — 24 мМ раствор.

4. АДФ — 90 мМ раствор.

5. MgCl2 — 180 мМ раствор.

6. КО - 0,6 М раствор.

7. НАДН — 3 мМ раствор (свежеприготовленный).

8. Лактатдегидрогеназа — коммерческий препарат (разводят перед использованием 100 мМ трис-HCl буфером (рН 7,6) до конечной концентрации 60 инт. ед./мл).

9. Фенилаланин — 60 мМ раствор.

10. Алании — 60 мМ раствор.

Получение растворимой клеточной фракции скелетных мышц крысы. Все процедуры по получению фракции проводят при 0°С. Среда выделения: 50 мМ трис-HCl буфер, рН 7,5.

Мышцы (^5 г) задних конечностей декапитированного животного помещают в ледяную среду выделения. После охлаждения ткань обсушивают фильтровальной бумагой, переносят в чашку Петри, стоящую на льду, очищают от жира и соединительной ткани, измельчают ножницами. Навеску тканевой кашицы гомогенизируют в стеклянном гомогенизаторе Поттера с тефлоновым пестиком, имеющим нарезку в 6-кратном

страница 168
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
rb 2573 gc вешалка напольная
платформа для пилатеса
вакансии с минивэн
домашняя акустика hi-end

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(25.04.2017)