химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

ипидные мембраны (липосомы). Кроме того, осуществляется практическое знакомство с различными аспектами кинетического исследования ферментов: осваиваются различные способы оценки кинетических параметров, ингибиторный анализ, проводится исслс

Все операции выполняются в холодной комнате; расiвиры предварительно охлаждаются до 4°С.

200 г измельченной массы скелетной мышцы кролика (приготовление см. на с. 221) гомогенизируют в четырех объемах буфера В в гомогенизаторе Уоринга 3 раза по 1 мин. Гомогенат центрифугируют при 10 ООО ^ в течение 30 мин. Супернатант фильтруют через три слоя марли. Стакан с экстрактом помещают в кристаллизатор со льдом и доводят рН на рН-метре до 6,8—7,0. К экстракту добавляют 150 мл плотного осадка ДЭАЭ-целлюлозы и перемешивают на магнитной мешалке в течение 30—40 мин. Ионообменнику дают осесть, жидкость сифонируют, ионообменник переносят в колонку (4x15 см). Колонку промывают буфером А до поглощения менее, чем 0,1 при 280 нм. Протеинкиназу элюируют буфером Б (примерно 150 мл) и к элюату добавляют сульфат аммония до 70%-ного насыщения (примерно 44 г на 100 мл элюата). Выпавший осадок белка собирают центрифугированием при 10 000 g в течение 40 мин, суспендируют в 10—15 мл буфера А и диализуют против 100 объемов того же буфера с 10%-ным глицерином в течение ночи. Денатурированный белок удаляют центрифугированием. К белковому раствору добавляют глицерин (примерно 1/3 объема). Определяют в препарате концентрацию белка по методу Спектора. Препарат хранят при — 20 °С в течение нескольких недель.

Определение цАМФ-связывающей активности

Реактивы:

1. Буфер Г: 50 мМ КН2Р04КОН, 1 мМ ЭДТА (рН 6,5), 5 мМ теофиллин, 2 М NaCl.

2. цАМФ — 0,1 мМ раствор в воде, рН 6—7 по индикаторной бумаге.

3. Буфер Д: 10 мМ КН2Р04-КОН, рН 6,5.

4. [8-3Н] цАМФ (Амершам).

5. Нитроцеллюлозные фильтры «Сын-пор» (24 мм) с диаметром пор 0,2 или 0,45 мкм.

6. Сцинтилляционная жидкость ЖС-106

Перед определением активности готовится среда инкубации и делается необходимое разведение протеинкиназы. К рассчитанному объему буфера Г добавляют нерадиоактивный цАМФ до концентрации 1 мкМ; радиоактивный цАМФ добавляется в таком количестве, чтобы в 10 мкл смеси был счет радиоактивности около 30 000 имп/мин (10 мкл из среды инкубации наносят на фильтр, сушат и просчитывают в сцинтилляторе ЖС-106). Разведение фермента проводят в отдельных пробах так, чтобы в 20 мкл раствора содержалось по 10, 20, 30, 40, 50 мкг белка соответственно. Среду инкубации раскапывают по 95 мкл в инкубационные пробирки. К пробам добавляют по 20 мкл соответствующего раствора протеинкиназы (в контрольную пробу добавляют 20 мкл буфера). Пробы инкубируют в холодильнике (или во льду) в течение 1,5—2 ч.

Перед фильтрацией нитроцеллюлозные фильтры раскладывают на кювете с фильтровальной бумагой. Под каждым фильтром подписывают на бумаге его порядковый номер. Колбу Бунзена подключают к водоструйному насосу, укладывают в воронку фильтр матовой стороной вверх. Фильтр сначала промывают 1 мл буфера Д и, не давая ему подсохнуть, наносят в его центр инкубационную смесь. После того как вся жидкость впиталась в фильтру проводят промывку холодным буфером Д (5—7 раз по 2 мл буфера). Фильтры выкладывают влажными на фильтровальную бумагу и сушат на воздухе. Затем просчитывают их радиоактивность в 5 мл сцинтилляционной жидкости ЖС-106.

Удельную активность рассчитывают по формуле: л

,7 нмоль

Удельное связывание,

мг

(счет радиоактивности в опытной пробе — счет радиоактивности в контрольной пробе)

(общий счет радиоактивности в 95 мкл пробы X количество белка в пробе, мг)

х количество цАМФ в пробе с учетом количества радиоактивного цАМФ, нмоль.

Определение фосфотрансферазной активности диссоциированного холофермента

Реактивы:

1. Буфер Е — 60 мМ трис-HCl, 0,1 мМ ЭГТА (рН 7,2), 5%-ный глицерин, 3 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотреитол.

2. АТФ — 1 мМ раствор в воде, рН 6—7 по индикаторной бумаге.

3. Гистон HI из тимуса теленка или сухой продажный гистоно-вый препарат («Олайне»).

4. Фильтры из бумаги ватман 3 ММ (18x18 мм).

5. Трихлоруксусная кислота — 6%- и 10%-ный растворы.

6. Ацетон.

7. Раствор Ж - 0,5 М ЭДТА, 5 мМ АТФ, 10 мМ NaH2P04, 10 мМ пирофосфат натрия, рН 7,0.

8. цАМФ — 1 мМ раствор в воде, рН 6—7 по индикаторной бумаге.

9. [у-32Р]АТФ (Амершам).

10. Сцинтилляционная жидкость ЖС-106.

Перед определением активности готовят среду инкубации и делают соответствующие разведения фермента. К рассчитанному объему буфера Е добавляют АТФ до конечной концентрации 50 мкМ, гистон HI — до концентрации 3 мг/мл, цАМФ — до концентрации 10 мкМ, радиоактивный АТФ — в таком количестве, чтобы счет радиоактивности в 10 мкл среды составлял около 40 000 имп/мин (Ю мкл среды наносят на фильтр, высушивают и просчитывают в сцинтилляторе ЖС-106 в «фосфорном» канале). Фермент разводят таким образом, чтобы в 20 мкл раствора было по 2, 3, 5, 7, 10 мкг белка соответственно. Фильтры нумеруют, надписывая их простым карандашом.

В инкубационные пробирки

страница 167
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
бухгалтерские курсы сзао
куплю радиаторы чугунные
подарочный набор для шашлыка
Металлические мусорные контейнеры, продажа металлических контейнеров для мусора

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(06.12.2016)