химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

В

Определение структуры антигенных детерминант

Существуют два класса антигенных детерминант — конформаци-онные и линейные. Конформационные детерминанты зависят от нативНой пространственной конформации беЛковой молекулы и состоят из аминокислотных остатков, не расположенных последовательно в полипептидной цепи, но благодаря укладке последней пространственно сближенных. В отличие от них линейные детерминанты представляют собой пептидные сегменты из 5—8 аминокислотных остатков. При изучении антигенной структуры фермента определяют структуры его антигенных детерминант путем изучения взаимодействия антител с пептидными фрагментами фермента.

Реактивы:

1. Лизоцим из куриного яйца.

2. Антитела к лизоциму.

3. Регуляторная субъединица цАМФ-зависимой протеинкиназы из мозга (RII).

4. Антитела к RII.

5. Все реактивы для ИФА (с. 320).

Лизоцим и RII в растворе с концентрацией 50 мкг/мл денатурируют кипячением. Берут два микропланшета для ИФА. На одном микропланшете, разделенном пополам, раститровывают нативный и денатурированный препараты лизоцима от 5 мкг до 5-10"5 мкг в лунке. На другом аналогичным образом раститровывают препараты RII. Микропланшеты инкубируют в течение ночи при 4°С. Тщательно отмывают. Вносят в лунки соответствующие антитела к лизоциму и к RII, инкубируют в течение 1 ч при 37 °С. Тщательно отмывают. Вносят конък -гаты антимышиных антител с ферментной меткой. Инкубируют в т чение часа при 37°С. Тщательно отмывают, вносят субстрат. Через 30 мин реакцию останавливают (с. 319) и определяют оптическую плотность на спектрофотометре при соответствующей длине волны. Строят графики зависимости оптической плотности (ось ординат) о.1 разведения антигена (ось абсцисс). Полученные графики должны сви детельствовать о том, что антигенные детерминанты лизоцима относят ся к конформационным и разрушение нативной структуры фермента полностью разрушает антигенные детерминанты (отсутствует специфическое связывание с денатурированным ферментом). В отличие от лизоцима антигенные детерминанты RII — линейные (специфическое связывание с денатурированным препаратом сохраняется).

Сравнение антигенных структур изоферментов

Реактивы:

1. Регуляторная субъединица цАМФ-зависимой протеинкиназы RII.

2. Антитела к RII.

3. Регуляторная субъединица цАМФ-зависимой протеинкиназы RI.

4. Все реактивы для ИФА (с. 320).

Раститровывают препараты регуляторных субъединиц RI и RII в микропланшете для ИФА, разделенном пополам в концентрациях от 5 мкг до 5-10~5 мкг в лунку (100 мкл). Инкубируют в течение ночи при 4°С, тщательно отмывают. Вносят по 100 мкл раствора антител к RII (5 мкг/мл), инкубируют в течение 1 ч при 37°С, тщательно отмывают. Вносят конъюгаты антимышиных антител с ферментной меткой, инкубируют в течение 1 ч при 37° С, тщательно отмывают. Вносят соответствующий субстрат. Через 30 мин определяют оптическую плотность на спектрофотометре и строят графики зависимости величины оптической плотности от разведения антигена. Полученные графики должны свидетельствовать о том, что антитела к RII не взаимодействуют с RI (отсутствует специфическое связывание). Следовательно, RII и RI иммунологически различны.

Сравнение антигенных структур белков из разных источников

Реактивы:

1. Инсулин свиной.

2. Инсулин бычий.

3. Все реактивы для ИФА (с. 320).

4. Антитела к свиному инсулину.

Готовят растворы двух препаратов инсулина в концентрации 100 мкг/мл и раститровывают в микропланшете для ИФА в концентрациях от 10 мкг до 5 ? 10—5 мкг в лунку. Инкубируют в течение ночи при 4°С, тщательно отмывают. В лунки вносят раствор антител к свиному инсулину в концентрации 10 мкг/мл по 100 мкл. Инкубируют в течение часа при 37 °С, тщательно отмывают. Вносят конъюгат антимышиных антител с ферментной меткой и инкубируют в течение часа при 37 °С. Тщательно отмывают и вносят соответствующий субстрат (с. 319). Через 30 мин определяют величину оптической плотности при соответствующей длине волны (с. 320). Строят графики зависимости величины оптической плотности от разведения антигена. Полученные графики должны свидетельствовать о том, что специфичность связывания антител к свиному инсулину значительно выше по сравнению со связыванием бычьего инсулина, хотя в последнем случае и наблюдается специфическое связывание. Такой результат свидетельствует о близком сходстве структур антигенных детерминант препаратов инсулина, однако исключает их тождество. Известно, что антигенные детерминанты этих двух белков различаются всего лишь одной аминокислотой.

Аналогичным образом можно оценивать антигенные структуры различных белков и ферментов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Д ж. Келер. Методы получения гибридом//Иммунология. Методы исследований/ /Под ред. И. Лефковитса, Б. Перниса. М., 1983. С. 313.

2. Моноклональные антитела, Гибридомы: новый уровень биологического анализа/ /Под ред. Р. Г. Кеннета, Дж. Мак-Керна, К. Б. Бехтола. М., 1983.

3. Остерман Л. А. Введение радиоактивной метки в белки//Исследование биологических макромолекул электр

страница 165
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
обучающии курсы мастера холодильных установок
миколог коломенская
сабвуферы урал купить
ктех 50-30-4

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(03.12.2016)