химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

определяет возможность применения тех или других антител. Иммуноанализ и гистохимические методы требуют антител с высоким сродством (/ССв=10-э—Ю-10), чтобы комплексы антигена с антителами были очень прочными С другой стороны, имму-ноаффинная очистка лучше осуществляется с низкоаффинными антителами (Ксв=10-6—10-7), поскольку в этих условиях адсорбция и освобождение антитела проходят при относительно мягких условиях без повреждения антигена и антител и колонка может использоваться повторно. Анализ взаимодействия антител с антигеном проводят по методу Скэтчарда (см. с. 343) с использованием радиоиммунного анализа.

Реактивы:

1. 125I-NaI - 0,5 мКи.

2. Хлорамин Т.

3. Na-фосфатный буфер — 0,4 М раствор, рН 7,5.

4. Na-фосфатный буфер — 0,05 М раствор, рН 7,5.

5. Тиосульфат Na.

6. «Дауэкс» 1x8.

7. Сыворотка кролика.

8. Кроличьи антимышиные антитела.

9. NaCl - 0,15 М раствор.

Введение радиоактивной метки в антитела. Готовят на Na-фос-фатном буфере 0,05 М следующие растворы: хлорамин Т — 2 мг/мл,. антитела — 1 мг/мл, тиосульфат Na — 2 мг/мл.

В полистироловую пробирку вносят по 100 мк раствора кроличьих антимышиных антител и Na-фосфатного буфера 0,4 М. К смеси добавляют 1 мКи 125I—Nal. При непрерывном перемешивании добавляют 50 мкл раствора хлорамина Т. Инкубируют в течение 1 мин. Реакцию останавливают добавлением 200 мкл тиосульфата Na. «Дауэкс» суспендируют в 0,15 М NaCl и помещают в 1—2 мл колонку. Через колонку пропускают 1 мл кроличьей сыворотки для предотвращения неспецифического связывания антител. Реакционную смесь пропускают через колонку с «Дауэксом» для удаления несвязавшегося 1251. Промывают колонку 1 мл 0,15 М NaCl. Раствор меченых антител (1 мл) смешивают с 1 мл 3%-ного раствора БСА в фосфатном буфере и хранят при 4°С.

Активность полученного препарата проверяют на у-счетчике после разбавления исходного раствора 3%-ным раствором БСА в фосфатном буфере в соотношении 1 : 100. 50 мкл раствора антител должны давать от 50 000 до 100 000 срт.

Определение константы связывания. Используют метод радиоиммунного анализа (РИА). Постановка метода сходна с постановкой4 ИФА (с. 320), с тем исключением, что вместо конъюгатов антител с ферментной меткой для выявления связывания антител с антигеном используют антимышиные антитела с радиоактивной меткой. В каждую лунку вносят по 50—100 мкл антимышиных антител (10—30 нг около 20 000 срт). Инкубируют при комнатной температуре около 2 ч. Затем микропланшеты тщательно отмывают (с. 321), разрезают и индивидуальные лунки просчитывают в у-счетчике.

Полученные данные наносят на график, где по оси абсцисс откладывают АВСВ (антитела, связанные с антигеном), а по оси ординат — отношение АТСВ к АТсвоб (антитела свободные). Через полученные точки проводят прямую, параметры которой рассчитывают по методу наименьших квадратов. Тангенс угла наклона полученной прямой соответствует КсвIV. ИЗУЧЕНИЕ АНТИГЕННОЙ СТРУКТУРЫ ФЕРМЕНТОВ

1. ОЧИСТКА АНТИГЕНОВ НА ИММУНОСОРБЕНТЕ С МОНОКЛОНАЛЬНЫМИ АНТИТЕЛАМИ

Реактивы:

1. Моноклональные антитела к растворимому белковому антигену (IgG к регуляторной субъединице цАМФ-зависимой проте-инкиназы).

2. BrCN — активированная сефароза 4В.

3. Бикарбонатный буфер — 0,1 М раствор, содержащий 0,5 М NaCl, рН 8,3.

4. Ацетатный буфер — 0,1 М раствор, содержащий 0,5 М NaCl, рН 4.

5. Глициновый буфер — 0,2 М раствор, рН 8.

6. Фосфатный буфер — 0,1 М раствор, рН 6,4.

7. Глициновый буфер — 2 М раствор, рН 2,8.

8. Трис-HCl - 2 М раствор, рН 8,6.

Приготовление иммуносорбента. BrCN-активированную сефарозу (1 г) обрабатывают, как обычно (с. 297). Полученный гель (3,5 мл) быстро промывают бикарбонатным буфером (рН 8,3) и вносят в раствор антител (20 мг антител в 10 мл бикарбонатного буфера). Инкубируют 2 ч при комнатной температуре, осторожно перемешивая механической мешалкой. Гель промывают в 100 мл того же буфера и переносят для блокирования оставшихся активных групп матрицы в 20 мл глицинового буфера 0,2 М, рН 8. Инкубируют 2 ч при комнатной температуре, постоянно осторожно перемешивая механической мешалкой. На воронке гель отмывают от несвязавшихся иммуноглобулинов и глицина бикарбонатным буфером (рН 8,3), затем ацетатным буфером, рН 4. Цикл повторяют, затем отмывают фосфатным буфером и хранят в нем при 4°С.

Очистка антигена. Цитозольную фракцию из мозга свиньи (с. 379) пропускают через колонку с иммуносорбентом (1x2 см) в фосфатном буфере (рН 7,4) и колонку промывают тем же буфером. Элюцию проводят 2 М глициновым буфером (рН 2,8), фракции нейтрализуют 2 М трис-HCl буфером, рН 8,6 Определяют концентрацию белка, цАМФ-связывающую активность (с. 331): она не должна быть ниже 12 нмоль/мг. Проверяют чистоту полученного препарата регуляторной субъединицы (м. м.=56 000 Да) методом электрофореза (с. 119). Таким же способом, имея моноклональные или поликлональные антитела к соответствующим антигенам, можно получить гомогенные препараты этих антигенов.

2. СРАВНЕНИЕ АНТИГЕННЫХ СТРУКТУР ИЗОФЕРМЕНТОВ И ФЕРМЕНТОВ ИЗ РАЗНЫХ ИСТОЧНИКО

страница 164
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(21.02.2017)