химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

тельно сорбированным антигеном, как указано выше. Титрование проводят по двум длинным рядам 96-луночного микропланшета для ИФА с плоским дном. Начальное разведение асцитной жидкости в фосфатном буфере выбирают равным 1:100 (50 мкл в лунку). Инкубируют при 37°С в течение часа. Микропланшет тщательно отмывают (не менее 3 раз) фосфатным буфером •с 0,05% твина-20. В лунки вносят по 50 мкл раствора конъюгата антимышиных антител с пероксидазой в фосфатном буфере с 1%-ным раствором БСА и снова инкубируют в течение 1 ч при 37° С. После тщательной отмывки вносят свежеприготовленный раствор субстрата пероксидазы АБТС (с. 319). Реакцию останавливают через 30 мин добавлением 50 мкл 1 н. H2S04 и определяют оптическую плотность, которая должна быть пропорциональна содержанию антител в данной лунке. Строят график зависимости оптического поглощения при 452 нм от степени разведения асцитной жидкости (рис. 40). Из полученного графика определяют титр антител в данной асцитной жидкости.

3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КЛАССОВ И ПОДКЛАССОВ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ

Реактивы:

1. Конъюгаты антимышиных IgG к тяжелым цепям иммуноглобулинов мыши: Ч\Ч2аУ2ьуз\1 с пероксидазой.

2. Все реактивы для ИФА (см. с. 320).

П Зак 4JR

321

Определение классов и подклассов антител важно для выбора? способа их очистки. Классы и подклассы моноклональных иммуноглобулинов, секретируемых специфическими гибридомами, определяют прямым методом ИФА (рис. 41).

о

+

AT

субстрат

''ис. 41. Схема «прямого» метода

определения антигена в ИФА. АГ — иммобилизованный антиген; AT—Е —- конъюгат антител с ферментной меткой

Берут 96-луночные микропланшеты из расчета по 2 лунки на одну гиб-ридому, вносят в каждую лунку па 50 мкл культур а льной жидкости специфических гибридом и инкубируют в течение ночи при 4° С. Затем тщательно отмывают фосфатным буфером с 0,05% твина-20. В каждую лунку вносят по 50 мкл раствора конъюгата антимышиных IgG к IgG и IgM с пероксидазой в фосфатном буфере с 1% БСА. Инкубируют 2 ч при комнатной температуре. Микропланшеты тщательно отмывают и в лунки вносят субстратную смесь (с. 319). Реакцию* останавливают через 30 мин, внося в лунки 50 мкл 10%-ного раствора ДСН. Полученные результаты учитывают на спектрофотометре при 452 нм. В культуральных жидкостях, содержащих моноклональные иммуноглобулины класса G, определяют подклассыз IgG точно так же, используя конъю-гаты антимышиных IgG к различным подклассам иммуноглобулинов с пероксидазой.

4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭПИТОПНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ АНТИТЕЛ

Реактивы:

1. Раствор антигена 1 мг/мл.

2. Моноклональные антитела к антигену (не менее 50 мкг/мл & 1% БСА).

3. Конъюгаты моноклональных антител с пероксидазой.

4. Все реактивы для ИФА (с. 320).

Для использования моноклональных антител в изучении белковых антигенов важно знать, с одной и той же или разными антигенным'и детерминантами (эпитопами) антигена связываются полученные антитела. Эпитопную специфичность антител определяют методом их конкурентного связывания. Антитела одного клона конъюгируют с пероксидазой (с. 317). Берут 96-луночный микропланшет для ИФА и сорбируют в лунках антиген, как обычно (с. 320). После тщательной отмывки в каждую из 12 лунок вносят по 75 мкл культуральной жидкости того же или других клонов или раствор очищенных антител — 100 мкг/мл (рис. 42). Все остальные лунки содержат 50 мкл фосфатного буфера с 1%-ным БСА. Делают серийные разведения антител, перенося по 25 мкл раствора из каждой лунки в соседнюю (рис. 42) на 5—6 лунок. К каждой лунке добавляют 10 мкл меченных пероксидазой антител в концентрацию 20 мкг/мл. Инкубируют 2—4 ч при комнатной температуре при постоянном встряхивании. После тщательной отмывки добавляют субстратную смесь (с. 319). Реакцию останавливают через 30 мин добавлением 50 мкл 10%-ного ДСН и определяют оптическую плотность при 452 нм. Строят графики зависимости оптической плотности от концентрации антител. Если антитела направлег— AT / —f 1— AT 2 —1 /

1— \Т1 + AT 2

/ 2 J 5 6 7 8 9 10 11

'О о о о о о о о о о о

'О о о о о о о о о о о

'О о о о о о о о о о о

'О о о о о о о о о о о

'О о о о о о о о о о о

' о о о о о о о о о о о

о о о о о о о о о о

«о о о о о о о о о о о

Рис. 42. Схема раститровки антител для определения эпитопной специфичности антител

ны к одной и той же антигенной детерминанте, будет получен график, представленный на рис. 43, Б. Если же антитела направлены к разным антигенным детерминантам, полученная зависимость будет аналогична представленной на рис. 43, Л.

Рис. 43. Конкуренция между антителами при связывании с антигеном, сорбированным на микропланшете: 1—AT 1, 2 — AT 2, 3 —

AT 1+AT 2. А — антитела не конкурируют за связывание, направлены к разным детерминантам; Б — антитела конкурируют за связывание, направлены к одной и той же детерминанте

5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АФФИННОСТИ АНТИТЕЛ

Аффинность моноклональных антител к антигену является важным параметром, мерой которого служит константа связывания Ксв.

Величина этого параметра

страница 163
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
диван спальный made in itali
таблички с телефонами служб на подъездах
pxc00-e.d
Boccia 3236-01

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(24.01.2017)