химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

ледующего 3-кратного отмывания в таких же условиях титруют конъюгат антител в буфере по длинному ряду микропланшета. Инкубируют в течение часа. После исчерпывающего отмывания вносят субстратную смесь.

Приготовление субстратных смесей. Для пероксидазы. 1) 5'-аминосалицило-вая кислота: 8 мг 5'-аминосалициловой кислоты растворяют в 10 мл нагретой до кипения дистиллированной воды, к раствору после остывания добавляют 20 мкл 1 н. NaOH и 1 мкл 30%-ной Н202;

Рис. 38. Схема «сэндвич»-метода определения

антигена в ИФА. AT—иммобилизованные антитела; АГ — определяемый антиген; AT—Е — конъюгат антител с ферментной меткой

AT

АГ

AT

О

субстрат

2) о-фенилендиамин: 20 мг субстрата растворяют в 10 мл фосфат-цит-ратного буфера (приготовление буфера: к 25,7 мл 0,2 М раствора Na2HP04 добавить 24,3 мл 0,1 М раствора лимонной кислоты, 50 мл дистиллированной воды и затем 5 мкл 30%-ной Н202); 3) АБТС: 22,6 мг субстрата растворяют в 1 мл воды, 0,1 мл полученного раствора добавляют к 10 мл нитратного буфера — 0,01 М раствор, рН 4,0 вносят 5 мкл 30%-ной Н202.

Для щелочной фосфатазы: 4-нитрофенилфосфат: 10 мг субстрата растворяют в 10 мл буфера, который готовят следующим образом: 97 мл диэтаноламина смешивают с 800 мл воды, добавляют 0,2 г NaN3, 0,1 г MgCl2*6H20 и доводят рН до 9,8 с помощью 1 н. раствора НС1; общий объем доводят до 1 л и хранят в темноте при комнатной температуре.

3 Любой белок, не дающий перекрестных реакций с антителами.

о 1 о

В случае, когда субстратом служит АБТС, реакцию останавливают через 30 мин добавлением 50 мкл 10%-ного раствора ДСН, определяют оптическую плотность при 452 ммк на специальном спектрофотометре с вертикальным лучом «Flow Lab». При использовании дру

гих субстратов оптическую плотность' определяют при соответствующей длине волны4, которую выбирают в зависимости от окраски продуктов реакции.

Рабочим титром конъюгата считается такое его разведение, которое в случае АБТС дает ярко-зеленое окрашивание с положительным антигеном, тогда как с отрицательным антигеном окрашивание должно быть сопоставимо с окраской субстратной смеси. При этом должно выявляться минимальное количество положительного антигена. При спектрофотометрическом анализе рабочим титром конъюгата бу: дет разведение, дающее в положительном контроле 1,5—1,2 опт. ед., а в отрицательном — не более 0,05 опт. ед. Если в положительном контроле значение оптической плотности будет ниже 1,2 опт. ед., использование такого конъюгата в работе нежелательно.

III. ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ АНТИТЕЛ

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СПЕЦИФИЧНОСТИ ГИБРИДОМ

Для определения специфичности гибридом используют, как правило, непрямой метод ИФА с использованием антивидовых антител, конъюгированных с ферментной меткой. В нашем случае используются

+

конъюгаты кроличьих антимышиных

>^ антител с пероксидазой, приготовлен\ ные, как описано выше (см. с. 317).

U^vl AT Общая схема непрямого метода ИФА представлена на рис. 39.

Реактивы:

анти1

Конъюгат антимышиных тел с пероксидазой.

2. АБТС.

3. Нг02 — 30%-ный раствор.

4. Твин-20.

5. Цитратный буфер — 0,01 М раствор, рН 4,0,

6. Фосфатный буфер — 0,01 М раствор, рН 7,4.

7. Бычий сывороточный альбумин (БСА) — 1%-ный раствор.

Рис. 39. Схема «непрямого» метода определения антител в ИФА. АГ — иммобилизованный антиген; AT — определяемые антитела; ААТ—Е — конъюгат антивидовых антител с ферментной меткой

4 Оптическая плотность для 5'-аминосалициловой кислоты измеряется при 450 нм, для о-фенилендиамина — при 492 нм, для 4-нитрофенилфосфата — при 405 нм.

л гк л

Берут 96-луночные микропланшеты для иммуноферментного анализа (ИФА) с плоским дном. Количество микропланшетов определяется числом исследуемых клонов гибридом. Раствор антигена в концентрации 1 мг/мл вносят в лунки микропланшетов в объеме 50 мкл и инкубируют: а) в течение ночи при 4°С; б) в течение 1 ч при 37°С. Затем микропланшеты интенсивно (не менее 3 раз) отмывают фосфатным буфером, содержащим 0,05% твина-20. Блокирование неспецифических мест связывания проводят 1%-ным раствором БСА по 100 мкл в лунку и инкубируют в течение 1 ч при 37 °С. БСА интенсивно отмывают фосфатным буфером с твином-20 и в лунки вносят по 50 мкл культуральной жидкости. Микропланшеты инкубируют одним из выше перечисленных способов, затем тщательно отмывают и вносят по 50 мкл конъюгата кроличьих антител. После инкубации в течение часа при 37 °С несвязавшиеся кроличьи антитела отмывают и вносят субстрат АБТС. Реакцию останавливают через 30 мин добавлением 50 мкл 1 н. H2S04 и определяют величину оптического поглощения на специальном спектрофотометре «Flow Lab» при 452 нм. В качестве положительного контроля используют сыворотку мышей, которые были иммунизированы данным антигеном и селезенки которых использовали для сливания. В качестве отрицательного контроля берут культур а льную среду из лунок, не давших рост клонов, или ростовую сргду.

2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТИТРОВ АНТИТЕЛ В АСЦИТНЫХ ЖИДКОСТЯХ

Асцитную жидкость титруют с предвари

страница 162
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
Рекомендуем компанию Ренесанс - расчет лестниц - быстро, качественно, недорого!
участки ижс до 1 млн на новой риге
барный стол для кухни купить
заказать плакат на улицу

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(29.06.2017)