химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

у молекулами антитела и фермента. Наибольшее практическое применение нашел метод получения иммунопероксидазных конъюгатов окислением углеводного компонента фермента периодатом натрия. В случае использования щелочной фосфатазы в качестве фермента-маркера применяют глутаровый альдегид, взаимодействующий с е-аминогруп-пами белковых молекул.

I. ПОЛУЧЕНИЕ КОНЪЮГАТОВ АНТИТЕЛ С ПЕРОКСИДАЗОЙ

Реактивы:

1. Пероксидаза из хрена (Rz-3).

2. NaIO4~~0,2 М раствор.

3. АБТС — 2,2/-азиноди-(3-этилбензтиазолин-6-сульфонат)-2Г\1Н4— 40 мМ раствор в воде.

4. Н202 — концентрированная (30%).

5. Твин-20.

6. Глицерин.

7. Ацетатный буфер — 0,001 М раствор, рН 4,4.

8. Фосфатный буфер — 0,01 М раствор, рН 7,2—7,4.

9. Бикарбонатный буфер — 0,2 М раствор, рН 9,5.

10. Цитратный буфер — 0,01 М раствор, рН 4,0.

II. Этиленгликоль — 0,64 М раствор.

12. NaBH4.

Окисление пероксидазы. Растворяют 5—10 мг пероксидазы в 1 мл дистиллированной воды при легком перемешивании до конечной концентрации 5 мг/мл. Концентрацию определяют по формуле Л40з*0,44Хг где X — фактор разведения, Ат — оптическая плотность раствора при 403 нм. К раствору фермента добавляют 0,2 М водный раствор NaJ04 до конечной концентрации 0,016 М. При этом раствор пероксидазы должен изменить цвет от золотисто-коричневого до зеленого. Инкубируют в темноте при легком перемешивании в течение 20 мин. Процесс окисления останавливают добавлением этиленгликоля до конечной концентрации 0,16 М. Смесь инкубируют при тех же условиях в течение 1 ч и диализуют против 1000-кратного объема ацетатного буфера при 4°С в течение 18—24 ч.

Связывание модифицированной пероксидазы с антителами. Определяют концентрацию антител в растворе по формуле Л28о(Х: 1,3),. где X — коэффициент разбавления. Оптимальное соотношение количества иммуноглобулинов к количеству' пероксидазы составляет 2:1. Прогревают раствор антител при 56 °С в течение 30 мин (в случае поликлональных антител). Доводят рН раствора антител и модифицированной пероксидазы до 9,5 бикарбонатный буфером. Растворы немедленно объединяют, внося раствор иммуноглобулинов по каплям, и инкубируют смесь при комнатной температуре в темноте в течение 2 ч при непрерывном легком перемешивании. Добавляют NaBH4 из расчета 1 мг NaBH4 на 1 мг пероксидазы и инкубируют еще 2 ч при тч* же температуре. Диализуют против 1000-кратного объема 0,01 М фо» фатного буфера. Диализ можно заменить гель-фильтрацией на сефа-* дексе G-25 или G-50 (с. 106). Фракции, содержащие конъюгат, окрашены в светло-коричневый цвет, вследствие чего могут быть собраны без использования какого-либо регистрирующего прибора, чисто визуально. В полученный конъюгат добавляют 50% глицерина и хранят при -20°С.

2. ПОЛУЧЕНИЕ КОНЪЮГАТОВ АНТИТЕЛ С ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗОИ

Реактивы:

1. Щелочная фосфатаза — препарат в сульфате аммония.

2. Фосфатные буферы — 0,05 и 0,15 М растворы, рН 7,2.

3. Глутаральдегид — 25%-ный раствор.

4. Трис-буфер - 0,05 М раствор, содержащий 0,001 М MgCl2, 5 %БСА, рН 8.

Берут 1,5 мг препарата щелочной фосфатазы и центрифугируют при 4500 g в течение 20 мин при 4°С. Осторожно удаляют супернатант и к осадку добавляют 0,5 мг очищенных иммуноглобулинов в концентрации 2,5 мг/мл в фосфатном буфере. Объем смеси доводят до 0,2 мл 0,05 М фосфатным буфером, рН 7,2. Раствор диализуют против фосфатного буфера 0,15 М (рН 7,2) в течение ночи, доводят объем до 0,5 мл и добавляют раствор глютаральдегида до конечной концентрации 0,2%, инкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч при осторожном перемешивании. Доводят объем до 2 мл 0,15 М фосфатным буфером и диализуют против того же буфера в течение ночи при 4°С. Затем раствор доводят до 10 мл трис-буфером и хранят при 4°С.

3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАБОЧЕГО ТИТРА КОНЪЮГАТОВ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ С ФЕРМЕНТНОЙ МЕТКОЙ

Реактивы:

1. Раствор антител.

2. Все реактивы для проведения ИФА (см. с. 320).

3. 5'-аминосалициловая кислота.

4. NaOH — 1 н. раствор.

5. о-фенилендиамин.

6. Фосфат-цитратный буфер — 0,2 М раствор Na2HP04, 0,1 М раствор лимонной кислоты.

7. АБТС.

8. 4-нитрофенилфосфат.

9. Диэтаноламин.

10. НС1 — 1 н. раствор.

11. H202 — концентрированный раствор.

12. Конъюгаты антител с ферментной меткой.

о

АГ

©

U^vJ AT

Рабочие титры антител определяют в реакции ИФА методом «шахматного титрования» с использованием «сэндвич»-метода ИФА. Суть метода заключается в использовании «подложки», т. е. слоя неспецифически сорбированных иммуноглобулинов, с которыми затем взаимодействует специфический антиген. Этот антиген в дальнейшем выявляется с помощью конъюгатов антител с ферментной меткой. Схема «сэндвич»-метода представлена на рис. 38. 96-луночный микропланшет заполняют раствором антител в концентрации 10 мкг/мл по 100 мкл в лунку и оставляют на ночь при 4°С. На следующий день после 3-кратного отмывания фосфатным буфером с твином-20 (с. 321) титруют положительный антиген по короткому ряду микропланшета, так же титруют отрицательный антиген3. После инкубации з течение 1 ч при 37° С и пос

страница 161
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
обучение на сервисное обслуживание котлов
Jacques Lemans 1-1851F
венчики fissler в москве
билеты на елку лунтик без наценки

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(03.12.2016)