химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

ку и хранят при 4°С до использования. Клетки гибридом освобождают от эритроцитов, лизируя их в NH4C1, подсчитывают и вводят мышам.

Методом ИФА (с. 320) определяют титры антител в асцитной жидкости. Затем ее концентрируют (NH4hS04 и хранят при 4° С до использования.

Очистка моноклональных антител

Очистка на белок А-сефарозе Реактивы:

1. (NH4)2S04 — насыщенный раствор.

2. NaOH — 2н. раствор.

3. Фосфатные буферы: А — 0,5 М раствор, рН 8,0;

Б - 0,1 М раствор, рН 8,0; В — 0,01 М раствор, содержащий 0,15 М NaCl, рН 7,2.

4. Цитратные буферы — 0,1 М растворы: а) рН 6,0; б) рН 4,5;

в) рН 3.

К 20 мл асцитной или культуральной жидкости при постоянном перемешивании добавляют по каплям 20 мл насыщенного раствора сульфата аммония, рН 6,5. Смесь оставляют на 1 ч при 4°С и затем центрифугируют. Супернатант отбрасывают, осадок растворяют в дистиллированной воде в 1/20 начального объема (1 мл) и диализуют против текущей воды в течение 3 ч, затем — против двух смен фосфатного буфера, рН 8,0.

1,5 г белок А-сефарозы суспендируют в 0,1 М фосфатном буфере,

рН 5,0 мл), и заполняют пипетку на 10 мл, взятую в качестве

колонки. Препарат отдиализованных антител наносят на колонку и промывают ее 25 мл уравновешивающего буфера. В случае, если антитела принадлежат к подклассу IgGl, их элюцию проводят нитратным буфером, рН 6,0. Антитела подклассов IgG2a и IgGS элюируют нитратным буфером, рН 4,5. IgG2b элюируют цитратным буфером, рН 3,0. В двух последних случаях фракции собирают в пробирки, содержащие 200—400 мкл 0,5 М фосфатного буфера (рН 8,0) для быстрой нейтрализации цитратного буфера. После каждого опыта колонку промывают фосфатным буфером и хранят при 4°С. Связывающая емкость белок А-сефарозы составляет около 20 мг IgG на 1 мл геля.

Полученные препараты антител диализуют против фосфатного буфера, рН 7,2. Определяют белок по методу Лоури (с. 81) и, если нужно, концентрируют препарат антител (с. 266) до 2—5 мг/мл и хранят при 4°С с добавлением 0,01% NaN3.

Очистка на ДЭАЭ - целлюлозе

Для очистки больших количеств моноклональных антител из ас-цитных жидкостей применяют хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе.

Реактивы:

1. Асцитная жидкость.

2. (NH4)2S04 — насыщенный раствор.

3. NaOH - 2 н. раствор.

4. Трис-HCl буферы, рН 7,8: А — 20 мМ раствор; Б - 20 мМ раствор, 20 мМ NaCl; В - 20 мМ раствор, 40 мМ NaCl; Г -20 мМ раствор, 400 мМ NaCl.

Асцитные жидкости центрифугируют при 50 000 g в течение 30 мин. Супернатант разбавляют в четыре раза холодным фосфатным буфером. Добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония при постоянном перемешивании и оставляют на 1 ч при 4°С. Центрифугируют при 5000 g в течение 10 мин. Осадок растворяют в буфере В и диализуют против буфера Б. Меняют буфер через 3—4 ч. Диализуют не менее 8 ч. Центрифугируют при 15 000 g в течение 10 мин для удаления денатурированных белков. Измеряют экстинкцию при 280 нм предварительно разбавленного в 100 раз раствора и по формуле (Л28о:1,25) рассчитывают содержание белка в миллиграммах (асцитные жидкости содержат обычно 25—35 мг/мл белка).

ДЭАЭ-целлюлозу, обработанную как обычно (с. 109), уравновешивают буфером Б. Объем сорбента выбирают из расчета 5—7 мг белка на 1 мл сорбента. Хроматографию проводят при комнатной температуре. Диализованный препарат антител разбавляют равным объемом буфера А и наносят на колонку со скоростью 1—2 мл/мин. Промывают буфером Б в объеме, равном 1/10 объема колонки. Элюируют линейным градиентом NaCl, создаваемым буферами Б и Г. Полный объем градиента равен 5—7 объемам колонки, время 20—22 ч. Каждые 10 мин собирают фракции. Большинство моноклональных антител элюируются между 40 и 80 мМ NaCl, остальные антитела — между 120—150 мМ NaCl. Фракции, соответствующие белковому пику, измеряют при 280 нм, добавляют NaCl до конечной концентрации 0,15 М. Очищенные IgG имеют чистоту 90% и содержат 1—2 мг IgG в 1 мл. Обычно выход IgG составляет от 1 до 6 мг из 1 мл асцитной жидкости.

Очистка иммуноглобулинов класса М (IgM)

Реактивы:

1. Сефадекс G-200.

2. Трис-HCl буфер — 0,1 М раствор, содержащий 0,5 М NaCl, рН 7,8.

3. Препарат антител.

IgM очищают гель-фильтрацией на сефадексе 67-200. Колонку готовят, как обычно (с. 107), размер колонки 2,5x90 см, скорость тока 12—15 мл/ч.

II. ПОЛУЧЕНИЕ КОНЪЮГАТОВ АНТИТЕЛ С ФЕРМЕНТНЫМИ МЕТКАМИ

Ферменты, используемые в ИФА в качестве маркеров, должны отвечать ряду требований: иметь высокую активность и стабильность-в условиях анализа; чувствительный и простой метод определения продуктов или субстратов ферментативной реакции; сохранять активность и стабильность после конъюгирования с антителами; быть доступным при высокой степени чистоты. Непременным условием является отсутствие фермента и его ингибиторов в исследуемых биологических жидкостях. Всем этим требованиям отвечают наиболее часто применяемые в ИФА пероксидаза и щелочная фосфатаза.

Наибольшее распространение получили методы введения ферментной метки, основанные на образовании ковалентной связи межд

страница 160
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
светодиодные панели кафе указания
качество воды из батарей отопления.
купить стулья мягкие недорого
шашки такси омск

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(05.12.2016)