химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

ной бане при 100 °С, охлаждают до 40°С и смешивают с равным объемом ростовой среды с 20% сыворотки плода коровы при 40 °С (все делают быстро во избежание застывания агара). Из чашек Петри с фидерными клетками пастеровской пипеткой полностью отбирают среду, в чашки заливают агар и оставляют до застывания агара. К подготовленным клеточным суспензиям добавляют по 4 мл агара и разливают в чашки Петри с предварительно застывшим агаром. Для каждой гибридомы получают по две чашки Петри с концентрацией клеток, различающейся в два раза. Чашки ставят во влажный С02-инкубатор с 5% С02 при 37 °С. В течение 1 — 2 нед в чашках Петри появляются колонии клеток, видимые невооруженным глазом как белые пятнышки. С помощью пастеровской пипетки отдельные клоны гибридом переносят в 96-луночные планшеты с фидерными селезеночными клетками в ростовой среде (200 мкл в лунку).

После того как клоны займут около 1/4 лунки, культуральные жидкости тестируют на присутствие специфических антител методом ИФА (с. 320). Позитивные клоны реклонируют методом предельных разведений.

Клонирование гибридом методом лимитирующего разведения

Реактивы:

1. Гибридомная среда (ГС). '2. Сыворотка плода коровы.

Накануне готовят 96-луночные микропланшеты с питающими клетками из расчета одна гибридома на один микропланшет. Микропланшеты ставят во влажный С02-инкубатор с 5% С02 при 37 °С. На следующий день готовят две суспензии гибридомных клеток в холодной среде из расчета 1 клетка в 100 мкл и 0,5 клетки в 100 мкл. Каждый 96-луночный планшет делят на две части и в каждые 48 лунок распределяют одну и другую клеточные суспензии одного клона гибридомы. Помещают микропланшеты в С02-инкубатор. Через 10— 14 дней проверяют рост колоний в микропланшетах и отбирают те, в которых колонии выросли в менее 30% лунок. Культуральные жидкости из этих лунок тестируют методом ИФА (с. 320) на присутствие специфических антител. Клетки из лунок, давших положительные реакции, последовательно наращивают в 96-, 24-луночных чашках и культуральных матрасах. Часть наросших клеток замораживают для сохранения и дальнейшего использования

Замораживание и оттаивание клеток

Реактивы:

1. Диметилсульфоксид (ДМСО).

2. Ростовая среда.

3. Сыворотка плода коровы.

4. Трипановый синий — 1%-ный раствор в фосфатном буфере.

Накануне замораживания заменяют среду, в которой культивируются гибридомы, на свежую. Клетки замораживают только в экспоненциальной стадии роста.

Среду для замораживания клеток получают смешиванием при 4°С 50% ростовой среды, 10% ДМСО и 40% сыворотки. Берут 50 мл суспензии клеток, осаждают их центрифугированием, удаляют супернатант. Клетки (5-Ю6—107) суспендируют в 1 мл среды для замораживания и переносят в специальные ампулы. Их выдерживают в течение часа при 4°С, затем помещают в коробку из пенопласта и переносят в холодильник на — 70 °С, где выдерживают в течение ночи. На следующий день ампулы с клетками помещают в жидкий азот.

Для размораживания клеток ампулы извлекают из жидкого азота, помещают в водяную баню при 37 °С. После полного размораживания клетки стерильно переносят в пробирки и отмывают центрифугированием в 50 мл ростовой среды. Супернатант удаляют, клетки суспендируют в свежей порции ростовой среды (15—25 мл) и помещают в культуральный матрас. На следующий день 100 мкл суспензии клеток смешивают со 100 мкл трипанового синего и подсчитывают живые клетки в камере Горяева (трипановый синий окрашивает только* поврежденные клетки). Жизнеспособность размороженных клеток обычно составляет не менее 80%.

Получение препаративных количеств моноклональных антител

Реактивы:

1. Ростовая среда (СИМД).

2. Бессывороточная среда (СИМД).

3. (NH4)2S04 — насыщенный раствор.

4. NaOH — 2 н. раствор.

5. Пристан — (2, 6, 10, 14-тетраметилпентадекан).

6. NH4C1 — 0,83%-ный раствор в трис-HCl буфере, рН 9,2.

7. Эфир.

8. Этанол — 70%-ный раствор в воде.

Наработка в культуре. Клетки гибридомы культивируют в течение 4—5 дней без смены среды. Клетки осаждают центрифугированием. Надосадок, содержащий моноклональные антитела, собирают и используют для их получения. Клетки суспендируют в свежей ростовой среде и культивируют таким же способом. Концентрируют полученную культуральную жидкость (NH4)2S04 (с. 308) и хранят при 4°С до использования.

2 Можно заменить вазелиновым маслом.

Наработка в асцитных опухолях мышей. За 10 дней до введения клеток мышам сингенной линии BALB/c вводят внутрибрюшинно 0,1 мл пристана2. Клетки в количестве 5-Ю6—107, суспендированные в 0,5 мл бессывороточной среды, вводят внутрибрюшинно. В течение 12—16 дней следят за образованием асцитной опухоли. Мышь с хорошо развитой асцитной опухолью эфтаназируют эфиром, моют в 70%-ном этаноле и фиксируют на препаровальном столике. С помощью стерильных инструментов (ножницы, пинцет) обнажают брюшину и вводят иглу шприца на 5 мл для забора асцитной жидкости. Переносят асцитную жидкость в пробирку и осаждают клетки центрифугированием. Асцитную жидкость стерильно переносят в другую пробир

страница 159
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
штендер раскладушка для рекламы цены
большой концерт филиппа киркорова шоу я
экраны на мероприятие москва
вентилятор rfd 70-40/35.6d

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(16.01.2017)