химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

в камере Го-ряева. Их количество должно быть не менее 107.

Кондиционированная среда (КС) — среда, в которой выращивались миеломные клетки в логарифмической стадии роста. Клетки удаляют центрифугированием в течение 8 мин при 800 об/мин.

Гибридомная среда (ГС). Среду для культивирования гибридных клеток (г'ибридом) готовят из равных объемой ростовой и кондиционированной среды.

Приготовление селективных сред. Предварительно готовят растворы А и ГТ.

Раствор А- 1,76 мг аминоптерина растворяют в 90 мл дистиллированной воды с 0,5 мл 1 н. NaOH. После доведения объема до 100 мл раствор нейтрализуют 0,5 н. НС1. Предохраняют от света.

Раствор ГТ: 136,1 мг гипоксантина и 37,8 мг тимидина растворяют в 100 мл дистиллированной воды при 45—50°С.

Растворы А и ГТ стерилизуют фильтрованием (размер пор — 0,22 ммк) и хранят в замороженном виде при — 20 °С.

Селективную среду ГАТ (гипоксантин, аминоптерин, тимидин) готовят на основе ГС с добавлением 5 мл растворов А и ГТ к 500 мл исходной среды. Селективную среду ГТ (гипоксантин, тимидин) готовят на основе ГС с добавлением 5 мл раствора ГТ к 500 мл исходной среды.

Приготовление 50%-кого раствора ПЭГ. В ПЭГ, стерилизованный автоклавированием, добавляют 0,8 мл ростовой среды без сыворотки, нагревают до полного растворения под, охлаждают до 4и"^, добавляют 0,1 мл диметилсульфоксида и используют для гибридизации.

Приготовление суспензии клеток селезенки. Извлеченную асептически селезенку помещают в чашку Петри с 5 мл ростовой среды без сыворотки, отмывают, надрезают стерильно капсулу и помещают в стеклянный гомогенизатор с неплотно прилегающим стеклянным пестиком. Очень осторожно выдавливают из капсулы клетки в бессывороточной среде, оставляют на 5 мин для осаждения крупных частиц и переливают в центрифужную пробирку объемом 50 мл. Доводят объем до 30 мл добавлением холодной бессывороточной среды и отмывают, клетки центрифугированием в течение 8 мин при 800 об/мин. Для удаления из суспензии клеток эритроцитов осадок суспендируют в 15 мл 0,83%-ного раствора NH4C1 на льду, через 5 мин инкубации осторожно подслаивают 10 мл любой сыворотки и центрифугируют в течение 8 мин при 800 об/мин. Тени лизированных в NH4C1 эритроцитов остаются в надосадке, который отбрасывается. Осадок чистых: спленоцитов суспендируют в 20 мл холодной бессывороточной среды и подсчитывают жизнеспособные клетки в камере Горяева в смеси 20 мкл клеточной суспензии с 1 мл 0,1%-ного раствора трипанового-синего. Жизнеспособные клетки (остаются неокрашенными) должны составлять не менее 80%.

Слияние клеток. Смешивают суспензии клеток миеломы и селезенки в соотношении 1 :10 и центрифугируют в течение 8 мин при; 800 об/мин. Супернатант полностью сливают. Осадок встряхивают и? по каплям добавляют 1 мл 50%-ного раствора ПЭГ с ДМСО в течение 1 мин при постоянном встряхивании пробирки. Клетки центрифугируют в следующем режиме: разгоняют центрифугу до 1000 об/мин и тут же выключают. После остановки центрифуги вынимают пробирку с осевшими клетками и суспендируют клетки встряхиванием в том же растворе ПЭГ. К суспензии клеток добавляют по каплям 1 мл бессывороточной среды в течение 1 мин, затем каждую последующую минуту удваивают объем, добавляя 2, 4, 8 и 16 мл соответственно при постоянном встряхивании пробирки до конечного объема 32 мл. Клетки центрифугируют в обычном режиме в течение 8 мин при 800 об/мин. Супернатант отбрасывают, клетки суспендируют в селективной среде ГАТ в концентрации 105—5-105 клеток в 1 мл. Полученную суспензию клеток распределяют в 96-луночные микропланшеты по 200 мкл в лунку (5—10 микропланшетов). Микропланшеты помещают во влажный СОг-инкубатор с 5% СОгЧерез 10—14 дней проверяют микропланшеты на появление клонов гибридом и заменяют среду ГАТ на среду ГТ, которую заменяют на свежую каждые 3 дня до тех пор, пока выросшие клетки не займут 1/4 площади лунок. Затем переходят на ГС, которую также заменяют на свежую каждые 2—3 дня. Когда клетки займут 1/3 площади лунок, гибридомы тестируют на специфичность методом ИФА (с. 320). Специфичные гибридомы реклонируют в полужидком агаре и далее — методом предельных разведений.

Клонирование гибридом в полужидком агаре

Накануне берут асептически селезенку неиммунизированной мыши и выделяют спленоциты (см. выше). После удаления эритроцитов клетки отмывают центрифугированием и суспендируют в ростовой среде. Суспензию спленоцитов разливают по 5 мл в чашки Петри из расчета одна гибридома на 2 чашки. Чашки Петри с клетками селезенки помещают в С02-инкубатор с 5% С02.

Готовят 2%-ный раствор агара в бессывороточной среде (СИМД); разливают по 10 мл в пробирки и стерилизуют автоклавированием. Хранят при 4°С.

Берут суспензии гибридомных клеток, отмывают центрифугированием при обычных условиях и подсчитывают в камере Горяева. Готовят две клеточные суспензии для каждой гибридомы: 2,5-103 клеток в 1 мл и 1,25-103 клеток в 1 мл. Суспензии готовят в холодной гибри-домной среде с 20% сыворотки плода коровы. Объем суспензии — по 2 мл.

Расплавляют агар в водя

страница 158
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
кирпич 250 120 65
лавочка чугунная бу
ремонт крыла мерседес без покраски
купить наклейки на автобус паз

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(21.09.2017)