химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

еримента по ^ттстоте, проводят дальнейшую очистку с применением ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе.

Если необходимо, концентрируют полученный препарат до конечной концентрации 30—40 мг/мл методом ультрафильтрации или другими альтернативными методами (с. 266). Определяют содержание белка (с. 80).

Берут ДЭАЭ-целлюлозу из расчета 1 г сухого сорбента на каждые 30 мг белка. Обрабатывают ее обычным способом (с. 109) и уравновешивают 0,01 М Na-фосфатным буфером, рН 7,5. Стеклянную колонку (1,5—2)Х50 см заполняют целлюлозой 1,5x40 или 2x30 см, уравновешенной фосфатным буфером, рН 7,5. Наслаивают не более 8 мл препарата у-глобулинов, содержащего 200—300 мг белка на колонку 1,5X40 см и не более 10 мл (250—400 мг) на колонку 2X30 см. Элюируют уравновешивающим буфером. Собирают фракции (20—30) по

О-— ivi мл, npuDi>^niui — » A x

Объединяют первые 5—6 фракций с самым высоким содержанием белка. Концентрируют до 15—20 мг/мл. Определяют содержание белка. Методом электрофореза определяют состав полученного препарата IgG. Диализуют против боратного буфера рН 8,4 в течение ночи при 4°С и хранят при — 20 °С. Здоровый кролик дает 100—200 мг IgG. Таким же образом можно получить поликлональные антитела к другим белковым антигенам.

2. ПОЛУЧЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

В сыворотке иммунизированных животных всегда накапливаются продукты, секретируемые многими клонами В-лимфоцитов. Сывороточные антитела при любых схемах иммунизации представляют собой смесь молекул антител, гетерогенных по специфичности, аффинности и классовой принадлежности, вследствие чего имеется неизбежная перекрестная реактивность иммунных сывороток с разными антигенами. Перекрестная реактивность делает трудным или невозможным идентификацию уникальных антигенов. Моноклональные антитела, в отличие от поликлональных, являются продуктами потомков всего лишь одной В-клетки, и поэтому препараты моноклональных антител имеют особые свойства, вытекающие из небывалой степени биохимической гомогенности: моноклональные антитела высокоспецифичны. Они направлены против одной и той же антигенной детерминанты; моноклональные антитела стабильны как эталоны в отношении специфичности и аффинности (прочности связи с антигеном). Исследователь может целенаправленно подобрать моноклон, вырабатывающий антитела только нужного «сорта», т. е. класса, подкласса, специфичности, аффинитета.

Иммунизация мышей

Для иммунизации используют мышей — самок инбредной линии BAL В/с в возрасте 8—12 нед.

Реактивы:

1, Адъювант Фрейнда.

2. Препарат белкового антигена.

Растворимые белковые антигены (50—100 мкг), смешанные с равным объемом адъюванта Фрейнда, вводят внутрибрюшинно. Через 2— 3 нед проводят повторную иммунизацию без адъюванта. Через 2—4 нед после последней иммунизации берут пробы крови из хвостовой вены мыши. Выбирают мышь с наиболее высоким титром антител в ИФА (с. 321). Проводят гипериммунизацию внутривенно в хвостовую вену (100 мкг) без адъюванта либо внутрибрюшинно в течение трех дней по 30 мкг. Через три дня после внутривенной гипериммунизации мышь забивают цервикальной дислокацией и берут селезенку. При гипериммунизации, проведенной внутрибрюшинно, мышь забивают на следующий день.

Гибридизация клеток

Общая схема получения моноклональных антител представлена на рис. 37.

1. Сыворотка плода коровы.

2. Донорская лошадиная сыворотка.

3. Бикарбонат Na — 7,5%-ный раствор.

4. L-глютамин — 200 мМ раствор.

5. Гентамицин — раствор 50 мг/мл.

6. Пируват Na — 10 мМ раствор.

7. HEPES-буфер — 10%-ный раствор.

о. n^i — 1 н. раствор. 9. NaOH — 5 н. раствор.

10. Трипановый синий — 0,5%-ный раствор.

11. Среда Игла в модификации Дульбекко (СИМД).

12. Гипоксантин.

13. Аминоптерин.

14. Тимидин.

15. Полиэтиленгликоль (ПЭГ) — м. м. 4000 Да. 16 Диметилсульфоксид (ДМСО).

Партнерами для гибридизации являются клетки селезенки предварительно иммунизированной мыши и клетки культивируемой мышиной миеломной линии Sp2/0—Agl4 или X63-Ag8.6.5.3., резистентные к 8-азагуанину.

Миеломные культуры. Клетки выращивают в среде Игла в модификации Дульбекко (СИМД) с добавлением 10% плодной сыворотки коровы, 10% донорской лошадиной сыворотки, 5% бикарбоната Na, 2% L-глутамина, 0,1% гентамицина и 1% пирувата Na. Доводят рН среды до 7,2—7,4 (по индикатору феноловому красному) 5н. раствором NaOH.

Плотность клеточной суспензии составляет 5• 105—5-Ю6 клеток в 1 мл. Клетки поддерживают в логарифмической стадии роста.

Приготовление суспензии миеломных клеток для гибридизации. Работа с клетками и культуральными средами должна проводиться в условиях, абсолютно стерильных! 50 мл среды с культивируемыми миеломными клетками, находящимися в логарифмической стадии роста, центрифугируют в течение 8 мин при 800 об/мин, надосадок сливают в отдельную пробирку. Клетки суспендируют в 50 мл холодной ростовой среды без сыворотки (бессывороточная среда), отмывают центрифугированием при тех же условиях и суспендируют в 20 мл холодной бессывороточной среды. Клетки подсчитывают

страница 157
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
деньги на пожертвование
участки в лесу новорижское
грузовые тележки для склада в москве
световой короб купить

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(24.06.2017)