химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

учае моноклональных антител значительно выше по сравнению с антисывороткой и позволяет использовать моноклональные антитела даже для детекции тонких конформационных изменений молекулы белка. Благодаря высокой чувствительности, с которой моноклональные антитела определяют антигенные детерминанты, их можно использовать для точного установления границ и структуры детерминант, а также для идентификации и выделения чистых специфических пептидных фрагментов антигена.

Целью данного раздела является освоение иммунилимичсслил методов и возможностей их использования в изучении антигенных особенностей ферментов.

В разделе изложены методы иммунизации животных и гибридизации клеток для получения поликлональных и моноклональных антител, методы получения препаративных количеств антител и их очистки, способы введения ферментных меток в антитела и антигены для использования в иммуноферментном анализе, способы введения радиоизотопных меток в антитела для радиоиммунного анализа, методы изучения антигенных свойств ферментов

I. ПОЛУЧЕНИЕ АНТИТЕЛ

1. ПОЛУЧЕНИЕ ПОЛИКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

Многие растворимые белки, ферменты в том числе, выделенные из различных тканей животных, обладают антигенными свойствами, т.е. при введении в организм вызывают в нем образование антител. Однако их антигенные свойства (иммуногенность) различаются, что проявляется в разной способности стимулировать продукцию антител. В известных пределах иммуногенность коррелирует с молекулярной массой антигена. Иммунохимически чистые антигены применяются обычно в виде 0,01 —1,0%-ных растворов, тогда как неочищенные антигены и смеси антигенов приходится вводить в большей концентрации. Слабоиммуногенные антигены необходимо вводить со стимуляторами иммуногенеза, из которых наиболее часто используют адъювант Фрейнда. Антисыворотки против растворимых нативных белков можно получить повторными инъекциями (внутримышечно, подкожно, внут-рикожно) эмульсии раствора белка с адъювантом или внутривенными инъекциями раствора белка без адъюванта.

Сыворотки со средними титрами антител1 содержат около 2 мг антител в 1 мл сыворотки.

Получение антисыворотки

Реактивы:

1. Адъювант Фрейнда.

2. Препарат антигена — очищенные иммуноглобулины класса G из сыворотки мыши (IgG).

Иммунизация кроликов. Для иммунизации берут несколько кроликов любого пола в возрасте от полугода до года и выбирают кролика с наивысшими титрами антител.

1 Титр антител — наибольшее разведение иммунной сыворотки, при котором еще наблюдается реакция антител с антигеном.

Схема иммунизации. Для получения антисывороток к мышиным IgG животным внутримышечно (в бедро) и подкожно (в области живота) в нескольких точках вводят 2 мл эмульсии из растворенного в физиологическом растворе IgG (1 мг/мл) и 1 мл адъюванта Фрейнда. Через месяц иммунизацию повторяют, вводя 500 мкг IgG в виде эмульсии с равным объемом адъюванта Фрейнда. Затем каждую вторую неделю в течение 6—8 нед вводят по 200 мкг IgG с адъювантом. Через 2 нед после последней иммунизации из краевой вены уха берут пробы крови и определяют титры антител методом иммуноферментно^ f / . .— алv«*win.xii\,iiiaayji w anкровопускание, отделяют сыворотку, 'определяют титры антител и выделяют IgG. Если нужно взять много крови, выбирают метод повторных пункций сердца. При хорошей экспериментальной технике кролики достаточно хорошо переносят взятие из сердца 40—60 мл крови в неделю.

Выделение IgG

Для выделения у-глобулинов из сыворотки кролика обычно используют метод трехкратного высаливания сульфатом аммония при конечном насыщении 33%. Соли затем удаляют диализом.

Реактивы:

1. (NH4)2S04 — насыщенный раствор.

2. NaOH — 2 н. раствор.

3. Na-фосфатный буфер — 0,01 М раствор, рН 7,5.

4. Боратный буфер — 0,01 М раствор, рН 8,45.

5. ДЭАЗ-целлюлоза.

6. Антисыворотка кролика к IgG мыши.

К насыщенному раствору (NH4)2S04 добавляют 2 н. NaOH и доводят рН до 7,8. При постоянном перемешивании медленно, по каплям к 50 мл сыворотки кролика добавляют 80 мл насыщенного раствора сульфата аммония (рН 7,8) и перемешивают в течение 2—3 ч. Центрифугируют суспензию при комнатной температуре 30 мин при 1500g. Первый осадок содержит все у-глобулины, другие глобулины и следы альбумина. Растворяют осадок в дистиллированной воде до начального объема сыворотки (50 мл). Очищают фракцию у-глобули-нов вторым и третьим осаждениями. После третьего осаждения растворяют осадок в боратном буфере (рН 8,45) до конечного объема 20— 25 мл. Удаляют сульфат аммония диализом при 4°С против боратного буфера в течение 2—3 дней со сменой буфера утром и вечером. Полученный после диализа препарат иммуноглобулинов обычно содержит небольшой осадок денатурированного белка и слегка опалесцирует. Центрифугируют при 4° С в течение 30 мин при 1400 g. В полученном препарате проверяют содержание белка и титров антител. Определяют белковый состав методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН (с. 119). Если полученный препарат у-глобулинов не отвечает требованиям эксп

страница 156
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
недееспособность очень пожилых людей
крылья на борт авто
мельница для пюре купить
трещина в корпусе гироскутера

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(09.12.2016)