химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

ойства этих мономеров* сравнив их со свойствами иммобилизованных форм другой степени олигомерности.

Реактивы:

1. Суспензия иммобилизованной лактатдегидрогеназы, связанной с матрицей через 1 субъединицу.

2. Суспензия иммобилизованной глицеральдегид-3-фосфатдегидро~ геназы из дрожжей, связанной с матрицей через 1 субъединицу.

3. Na-фосфат — 0,1 М раствор, содержащий 5 мМ ЭДТА и 1 мМ дитиотреитол, рН 8,3.

4. Растворы мочевины концентрации 1 М, 2 М, 3 М, 4 М, 5 М, 6 М, 7 М и 8 М, приготовленные на вышеуказанном растворе Na-фосфата, рН 7,5.

Суспензию сефарозы с иммобилизованной дегидрогеназой промывают 10-кратным объемом раствора мочевины, смешивают с 4-кратным объемом раствора мочевины той же концентрации и инкубируют суспензию при перемешивании. За ходом инактивации следят, измеряя активность фермента на носителе. Через каждые 10 мин из инкубационной смеси отбирают аликвоты препарата дегидрогеназы и без отмывания геля от мочевины вносят их в стандартную систему для определения активности. Реакцию начинают добавлением субстрата через 10 с после внесения суспензии сефарозы. Исследуют влияние концентрации мочевины на процесс инактивации фермента. Оптимальной концентрацией мочевины является такая, которая позволяет провести денатурацию 3 из 4 субъединиц дегидрогеназы и перевести эти субъединицы в раствор. Подбирая концентрацию мочевины, следует получить такую зависимость инактивации фермента от времени, на которой будет выраженное плато на уровне 25% от исходной активности. При определении белка и активности на разных стадиях денатурации можно показать, что в начале плато в связанном с матрицей состояний находится димер дегидрогеназы, сохраняющий 50% от исходной удельной активности. При сохранении в процессе инкубации активности такого димера происходит постепенное отщепление неактивной субъединицы, а в связанном с матрицей состоянии остается активный мономер дегидрогеназы. Препарат иммобилизованного мономера отмывают от мочевины и денатурированного белка Na-фосфатом. Проводят сравнение каталитических характеристик иммобилизованных мономеров и тетрамеров.

Доказательством получения иммобилизованных мономеров служит их способность к реассоциации с растворимыми субъединицами с восстановлением тетрамерной структуры. Для реассоциации необходимо провести инкубацию иммобилизованных тетрамеров с денатурированными растворимыми субъединицами дегидрогеназы.

Реассоциация иммобилизованных мономеров глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из дрожжей с растворимыми субъединицами

Для получения растворимых денатурированных субъединиц апо-<фермент глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из дрожжей в концентрации 2,5—3,5 мг/мл инкубируют в течение 1 ч в 8 М растворе мочевины (за полнотой денатурации следят по изменению активности фермента). Полностью денатурированные субъединицы добавляют к суспензии иммобилизованных мономеров в 8-кратном избытке по отношению к связанному с сефарозой белку. Эту процедуру проводят трижды с 30-минутными интервалами между добавками при постоянном перемешивании и температуре 25° С. Несвязавшийся белок отмывают 0,1 М Na-фосфатом. Определяют содержание белка и активность в препарате после реассоциации.

5. ИММОБИЛИЗАЦИЯ ФОСФОГЛИЦЕРАТКИНАЗЫ И ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ СИНТЕЗА 1,3-ДИФОСФОГЛИЦЕРАТА

Иммобилизацию фосфоглицераткиназы проводят, как описано выше, используя препараты сефарозы, активированные 30 мг BrCN на 1 г геля. Препараты иммобилизованной фосфоглицераткиназы могут -быть использованы для синтеза 1,3-дифосфоглицерата и для определения активности глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы в реакции восстановительного дефосфорилирования 1,3-дифосфоглицерата.

Реактивы:

1. Суспензия иммобилизованной глицеральдегид-3-фосфатдегидро-геназы в Na-фосфате буфере (0,1 М, рН 8,3) — буфер А.

2. Суспензия иммобилизованной фосфоглицераткиназы в буфере А (1 : 1).

3. Триэтаноламин — 100 мМ раствор, рН 7,5.

4. НАДН — 60 мМ раствор.

5. АТФ — 180 мМ раствор.

6. 3-фосфоглицериновая кислота — 0,5 М раствор.

7. MgS04 — 0,5 М раствор.

Активность глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы определяют, используя сопряженную систему, в которой синтез 1,3-дифосфоглицерата осуществляют с помощью иммобилизованной фосфоглицераткиназы. В пробу объемом 3 мл вносят 0,1—0,3 мл суспензии иммобилизованной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и 0,1 мл суспензии иммобилизованной фосфоглицераткиназы (10—20 единиц активности). Концентрации остальных компонентов следующие: НАДН — 2 мМ,

АТФ — б мМ, MgSC>4—16 мМ, З-фосфоглицериновая кислота —16 мМ.

Реакцию начинают внесением 3-фосфоглицериновой кислоты и измеряют спектрофотометрически снижение концентрации НАДН при постоянном перемешивании.

ЛИТЕРАТУРА

1. Муронец В. И., Наградова Н. К. Иммобилизованные олигомерные ферменты. М., 1984.

2. Муроиец В. И., Чередникова Т. В., Наградова Н. К. Использование иммобилизации для изучения глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. Иммобилизованные тетрамеры//Биохимия. 1981. Т. 46, № 10. С. 1731.

3. Муронец В. И., Головина Т

страница 154
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
фильтр карманный 20 20
фотоэлемент agr4 502 1131 0
5 sos концерт в москве 2017
рабица полимерная цена

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(27.06.2017)