химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

ция олигомерного иммобилизованного фермента может быть индуцирована специфическими воздействиями {например, диссоциация иммобилизованной глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы из дрожжей на димеры) или обработкой денатурирующими реагентами (например, мочевиной).

Получение денатурированных иммобилизованных субъединиц глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы

Перед проведением экспериментов по получению форм дегидрогеназы разной степени олигомерности необходимо доказать, что исходный тетрамер связан с матрицей только через одну из субъединиц. Для этого необходимо обработать иммобилизованные препараты фермента в жестких условиях: их подвергают длительной инкубации в 8 М мочевине, затем удаляют денатурированные и перешедшие в раствор субъединицы и определяют содержание белка до и после обработки. Используя препараты BrCN-активированной сефарозы, полученные при разной концентрации BrCN, можно показать, что в зависимости от степени активации сорбента изменяется число субъединиц фермента, вовлеченных в ковалентную связь с матрицей.

Реактивы:

1. Мочевина — 8 М раствор.

2. Na-фосфат — 0,1 М раствор, содержащий 5 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотреитол, рН 8,3.

3. Суспензия сефарозы с иммобилизованной глицеральдегид-3-фос-фатдегидрогеназой — из дрожжей или скелетных мышц (кролика или крысы).

дегидрогеназы (степень активации сефарозы — от 3 до 250 мг BrCN «а 1 г геля) промывают на стеклянном фильтре 0,1 М Na-фосфатом, затем 5-кратиым объемом 8 М раствора мочевины. К осажденному центрифугированием гелю сефарозы добавляют равный объем 8 М мочевины и инкубируют при перемешивании в течение 20 ч на холоде. Препараты промывают 5-кратным объемом 8 М раствора мочевины, а затем отмывают от нее и от денатурировавшего и перешедшего в раствор белка, связанного с сефарозой, до и после обработки мочевиной. Рассчитывают число субъединиц, вовлеченных в ковалентную связь с носителем.

Для последующих экспериментов по получению иммобилизованных субъединиц используют те препараты, в которых тетрамер глице-ральдегид-3-фосфатдегидрогеназы связан с матрицей только через одну субъединицу.

Получение нативных иммобилизованных димеров глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из дрожжей

Растворимая глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа из дрожжей при инкубации на холоде в присутствии АТФ и хлористого натрия диссоциирует на димеры и теряет свою активность. Диссоциация тет-рамера иммобилизованной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы позволяет получить связанные с матрицей димеры и исследовать их свойства. Стабилизирующее действие носителя приводит к получению димеров, сохранивших нативную конформацию.

Цель задачи — получить иммобилизованные димеры и сравнить их свойства со свойствами иммобилизованных тетрамеров.

Реактивы:

1. Суспензия глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, связанной с сефарозой через 1 субъединицу.

2. Na-фосфат — 0,1 М раствор, содержащий 5 мМ ЭДТА и 1 мМ дитиотреитол, рН 8,3.

3. АТФ — 100 мМ раствор, приготовленный на 0,15 М NaCl, содержащем 5 мМ ЭДТА и 1 мМ дитиотреитол, рН 7,5.

Препараты иммобилизованной глицеральдегид-3-фосфатдегидроге-назы промывают 10-кратным объемом 0,15 М NaCl. Добавляют к осажденному центрифугированием гелю равный объем раствора АТФ и инкубируют суспензию при 4° С в течение 2 ч. После окончания инкубации препараты промывают 0,1 М Na-фосфатом для отделения денатурированного белка и АТФ до полного исчезновения поглощения элюата при 260 и 280 нм. В полученных препаратах иммобилизованных димеров определяют активность и содержание белка. Такого рода определения можно проводить и в процессе инкубации с АТФ для выяснения особенностей протекания процесса диссоциации иммобилизованного тетрамера.

При инкубации иммобилизованных димеров в течение 1 ч при температуре 25° С в присутствии апофермента дегидрогеназы из дрожжей в концентрации 0,15—0,20 мг/мл в 0,1 М Na-фосфате (рН 7,2) наблюдается реассоциация дегидрогеназы до тетрамеров. Эффективность реассоциации (после инкубации с растворимым ферментом и отмыва.шл luumma ipcpMcma; Mu*ei иьиь установлена на основании измерения активности и белка в препарате.

Получение нативных иммобилизованных мономеров глицеральде-гид-3-фосфатдегидрогеназы из дрожжей и лактатдегидрогеназы из скелетных мышц кролика

При обработке иммобилизованных тетрамеров дегидрогеназ 8 М раствором мочевины могут быть получены ковалентно связанные с сефарозой мономеры. Однако в процессе длительной инкубации в мо: чевине они теряют активность из-за денатурации. Подбирая концентрацию мочевины и время инкубации, можно провести избирательную денатурацию всех субъединиц тетрамера дегидрогеназы, за исключением той, которая связана с матрицей ковалентно, так как за счет стабилизирующего действия матрицы именно эта субъединица является наиболее устойчивой к действию мочевины.

Цель задачи — используя растворы мочевины разной концентрации, подобрать оптимальные условия для получения иммобилизованных мономеров глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы и исследовать каталитические св

страница 153
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
ремонт холодильников в текстильщиках
трансфер в аэропорты москвы
скорпионс когда приезжают в москву
клапан кву-1600х1000 с ручным упр

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(23.07.2017)