химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

ванной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из дрожжей получают при степени активации сефарозы 150 мг BrCN на 1 г геля.

Лактатдегидрогеназу, используемую для регенерации кофактора, и фосфоглицераткиназу иммобилизуют при степени активации 50 и 30 мг BrCN на 1 г геля сефарозы.

Перед использованием иммобилизованных ферментов в дальнейшей работе (а также для определения белка и активности в препаратах) готовят исходную суспензию. Для этого гель сефарозы промывают нужным буфером, центрифугируют в мерных цилиндрах при 1000 g в течение 1 мин и к осевшему гелю добавляют буфер из расчета 1 мл на 1 мл геля. Перед отбором проб из суспензии ее каждый раз тщательно перемешивают. При хранении суспензии к ней добавляют дитиотреитол в конечной концентрации 1—2 мМ.

ЛИТЕРАТУРА

1. Берез и н И. В. и др. Иммобилизованные ферменты. М., 1976. Т. 1, 2.

2. Введение в прикладную энзимологию. М., 1982.

3. Три вен М. Иммобилизованные ферменты. М., 1983.

4. Methods in Enzymology. N. Y., 1976. Vol. 44.

3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ

Активность иммобилизованных ферментов можно определить практически всеми известными методами (непрерывными и периодическими, спектрофотометрическими, рН-метрическим, флуоресцентными, химическими и др.). При работе с иммобилизованными ферментами не* обходимо постоянно перемешивать реакционную смесь в процессе измерения активности, так как в противном случае по мере оседания частиц носителя активность будет уменьшаться. При определении активности ферментов методом отбора проб обычное осаждение белка (например, трихлоруксусной кислотой) в случае иммобилизованных препаратов можно заменить отделением фермента фильтрованием или центрифугированием.

ипределение UKIинмис i и i лицсрйлодс! пд-о-^ич^а!rtvi nttpvi чшл»

Активность фермента определяют спектрофотометрически по нарастанию оптической плотности при 340 нм за счет образования НАДН из НАД.

Реактивы:

1. Глициновый буфер — 0,1 М раствор, рН 9,5.

2. Трис-HCl буфер — 0,05 М раствор, рН 8,0.

3. НАД — 60 мМ раствор.

4. 3-фосфоглицериновый альдегид — 45 мМ раствор.

5. Арсенат натрия — 0,15 М раствор.

6. ЭДТА — 0,15 М (можно приготовить смесь ЭДТА и арсената натрия указанных концентраций и довести рН смеси до 7,5).

При определении активности иммобилизованной дегидрогеназы из скелетных мышц кролика используют буфер с рН 9,5, а для фермента из дрожжей — буфер с рН 8,0. Реакционная смесь общим объемом 3 мл содержит ОД—0,2 мл суспензии иммобилизованной глицеральде-гид-3-фосфатдегидрогеназы (2—20 мкг фермента) и следующие компоненты (даны конечные концентрации): 3-фосфоглицериновый альдегид — 1,5 мМ, НАД — 2 мМ, арсенат натрия — 5мМ, ЭДТА — 5 мМ, глициновый буфер — 0,1 М, рН 9,5 (для фермента из мышц кролика) или трис-HCl буфер — 0,05 М, рН 8,0 (для фермента из дрожжей). Реакцию начинают добавлением 3-фоофоглицеринового альдегида и при непрерывном перемешивании определяют скорость образования НАДН в течение 1—2 мин.

Определение активности лактатдегидрогеназы

Активность фермента определяют спектрофотометрически по уменьшению оптической плотности при 340 нм за счет окисления НАДН.

Реактивы:

1. Калий-фосфатный буфер — 0,1 М раствор, рН 7,4.

2. ЭДТА — 30 мМ раствор.

3. НАДН — 60 мМ раствор.

4. Пируват — 24 мМ раствор.

Реакционная смесь общим объемом 3 мл содержит 0,1—0,2 мл суспензии иммобилизованной лактатдегидрогеназы (2—30 мкг белка фермента) и следующие компоненты (даны конечные концентрации): ЭДТА — 1 мМ, НАДН — 2 мМ, пируват — 0,8 мМ, К-фосфат — 0,1 М, рН 7,4. Реакцию начинают добавлением пирувата и при непрерывном перемешивании определяют убыль НАДН по уменьшению оптической плотности (с. 388).

Определение активности фосфоглицераткиназы

Активность фосфоглицераткиназы определяют в сопряженной системе в присутствии избытка глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеиазы по уменьшению концентрации НАДН.

1. Триэтаноламин — ОД M раствор, рН 7,5.

2. НАДН — 60 мМ раствор.

3. АТФ —90 мМ раствор.

4. З-фосфоглицериновая кислота — 0,5 М раствор.

5. MgS04 — 0,5 М раствор.

6. Раствор глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы — 300 ед/мл (2—5 мг/мл).

Реакционная смесь общим объемом 3 мл содержит 0,1—0,2 мл суспензии иммобилизованной фосфоглицераткиназы и следующие компоненты (даны конечные концентрации): НАДН — 2 мМ, АТФ — 3 мМ, З-фосфоглицериновая кислота — 16 мМ, MgS04 — 16 мМ, гли-церальдегид-3-фосфатдегидрогеназа — 10 ед. на пробу. Реакцию начинают добавлением 3-фосфоглицериновой кислоты и при непрерывном перемешивании определяют убыль НАДН по уменьшению оптической плотности (с. 388).

4. ПОЛУЧЕНИЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ СУБЪЕДИНИЦ ОЛИГОМЕРНЫХ ФЕРМЕНТОВ

Препараты олигомерных ферментов, связанных с матрицей через одну из субъединиц, могут быть использованы для получения иммобилизованных форм ферментов разной степени олигомерности. Сравнение каталитических свойств этих форм и их стабильности позволяет сделать выводы о роли четвертичной структуры в функционировании ферментов-олигомеров. Диссоциа

страница 152
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
узи кисти руки цена
http://taxiru.ru/galereja/
мебельные ручки для кухни купить
смета на устройство шумоизоляции под домашний кинотеатр

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(22.10.2017)