химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

. 367.

IV. ИММОБИЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ НА BrCN-СЕФАРОЗЕ 1. ПОЛУЧЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ BrCN-АКТИВИРОВАННОЙ СЕФАРОЗЫ

Реактивы:

1. Бром (Вг2) (при работе с бромом необходимо соблюдать меры предосторожности).

2. KCN (или NaCN) — 2,8 М раствор.

3. 0,1 М Na-фосфат, рН 11.

4. 0,1 М Na-фосфат, содержащий 5 мМ ЭДТА, рН 8,3.

5. К3РО4 — 1 М раствор, рН 11.

6. Диоксан (перегнанный).

Для активации сефарозы используют коммерческие препараты BrCN или синтезированный в лаборатории BrCN. Синтезированный BrCN может использоваться в течение 1—3 дней.

Внимание! Все работы с цианидами (KCN, NaCN, BrCN), в том числе процедуры по синтезу и дальнейшему использованию BrCN, необходимо производить в специально приспособленных помещениях с мощными вытяжными шкафами в соответствии с инструкциями.

Синтез BrCN. В круглодонную колбу на 50 мл вносят 0,2 мл дистиллированной воды, 2,6 мл Вг2 и магнит в стеклянной оболочке для перемешивания. Горлышко колбы закрывают притертой делительной воронкой. Колбу устанавливают в ледяной бане на магнитную мешалку и при осторожном перемешивании охлаждают. Делительную воронку заполняют раствором KCN на воде (20 мл) и по каплям добавляют его к брому при постоянном перемешивании. В процессе до&аВЛеНИЯ раСТВОра J\^1N красно-киричнеьыи цвс! жидшии а лилис

переходит в желтый, а затем в белый. Одновременно в колбе выпадает белый осадок кристаллов BrCN. При появлении белой окраски добавление KCN прекращают, а перемешивание продолжают еще в течение 10 мин. BrCN перегоняют при температуре 80—90° С в глицериновой бане в сухую круглодонную двугорлую колбу.

Активация сефарозы. Сефарозу 4В промывают на стеклянном фильтре (типа G-3) 10-кратным объемом 0,1 М Na-фосфата (рН 11), затем бидистиллированной водой до нейтральных значений рН. Слегка подсушенную на фильтре током воздуха сефарозу взвешивают и заливают 1 М К3РО4 (рН 11): 1 мл на 1 г сефарозы. К полученной суспензии, предварительно охлажденной до 4° С, добавляют при постоянном перемешивании раствор BrCN в воде (5%) или в диоксане (20%) из расчета 5 мг BrCN на 1 г сефарозы. После 7-минутной инкубации суспензию сефарозы переносят на стеклянный фильтр и быстро промывают сначала 20-кратным объемом охлажденной бидистиллированной воды, затем 20-кратным объемом 0,1 М Na-фосфата, содержащего 5 мМ ЭДТА, рН 8,3.

Полученные препараты активированной сефарозы используют для иммобилизации НАД-зависимых дегидрогеназ. При данной степени активации тетрамерные молекулы глицеральдегид-3-фосфатдегидроге-назы и лактатдегидрогеназы связываются с матрицей только через одну из субъединиц. Для связывания ферментов за несколько субъединиц и для получения иммуносорбентов препараты сефарозы активируют большим количеством BrCN: 50—250 мг на 1 г сефарозы. Для поддержания постоянных значений рН в процессе активации сефарозы при степени активации 50—70 и 200—250 мг BrCN на 1 г сефарозы следует использовать соответственно 2 М и 4 М К3РО4, рН 11. При высоких степенях активации предпочтительно использовать раствор BrCN в диоксане, а не в воде, так как в первом случае его растворимость значительно выше.

2. ИММОБИЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ

Реактивы:

1. Na-фосфат — 0,1 М раствор, содержащий 5 мМ ЭДТА, рН 8,0 (буфер А).

2. Раствор глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из дрожжей или скелетных мышц кролика в буфере А — концентрация 0,7—1,2 мг/мл.

3. Раствор лактатдегидрогеназы в буфере А — концентрация 0,7—1,1 мг/мл.

4. Раствор фосфоглицераткиназы в буфере А — концентрация 0,7—1,2 мг/мл.

5. Глицин.

Растворы ферментов готовят непосредственно перед проведением иммобилизации: суспензию фермента в сульфате аммония растворяют в буфере А (предпочтительно отцентрифугировать кристаллы фермента и их растворить в буфере А), затем обессоливают на колонке с сефадексом G-25 или G-50, уравновешенным тем же буфером. Оптимальная концентрация фермента ?— около 1 мг/мл. Повышение концентрации ucjiivd нсцслссииирални, idJi как в эшм случае количество связанного с сефарозой белка увеличивается незначительно. Понижение концентрации белка в случае олигомерных НАД-зависимых дегидрогеназ приводит к диссоциации этих ферментов на димеры, и последующая иммобилизация таких препаратов не позволяет получить связанные с матрицей тетрамеры дегидрогеназ.

К активированной сефарозе добавляют равный объем раствора фермента (1 мл на 1 г сефарозы) и инкубируют при комнатной температуре в течение 2,5—3,0 ч при перемешивании. К суспензии добавляют сухой глицин до конечной концентрации 50 мМ и оставляют при перемешивании в холодной комнате на ночь. Сефарозу отмывают в колонке или на стеклянном фильтре буфером А от неспецифически адсорбировавшегося белка и глицина до исчезновения в элюате поглощения при 280 нм и прекращения активности фермента.

Для выполнения задач по получению иммобилизованных субъединиц глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы иммобилизацию проводят на сефарозе, активированной низкими концентрациями BrCN (3—5 мг BrCN на 1 г геля).

Иммуносорбенты на основе иммобилизо

страница 151
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
купить бутсы в омске
стильные пепельницы
как выбрать нож для пиццы
бачок для дачного умывальника

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(05.12.2016)