химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

зиматической системе с гексокиназой и дегидрогеназой глюкозо-6-фосфата по количеству образующегося НАДФН по следующей схеме:

А креатинкинлза

креатинфосфат + АДФ *" АТФ + креатин

глюкоза

гексокиназа

АДФ

г люкозо-6-фосфат (- НАДФ+ НАДФН + Н+

дегидрогеназа глюкозо-б-фосфата

6-фосфоглюконолактон

Реактивы:

1. Трис-HCl буфер — 100 мМ раствор, рН 7,2.

2. Креатинфосфат — 200 мМ раствор.

3. АДФ — 20 мМ раствор, рН 7,0.

4. Mg(CH3COO)2 — 600 мМ раствор.

5. АМФ — 200 мМ раствор, рН 7,0.

6. Глюкоза — 40 мМ раствор.

7. НАДФ — 5 мМ раствор, рН 7,0.

8. Дитиотреитол — 30 мМ раствор.

9. Креатинкиназа.

10. Гексокиназа.

11. Дегидрогеназа глюкозо-6-фосфата.

Ферменты растворяют в 50 мМ трис-HCl буфере, рН 7,2.

В спектрофотометрическую кювету вносят следующие компоненты (указаны конечные концентрации): 50 мМ трис-HCl, рН 7,2; 1,0 мМ АДФ; 30—10 мМ Mg(CH3COO)2; 2 мМ глюкозу; 0,25 мМ НАДФ; гексокиназу 0,5 ед/мл; дегидрогеназу глюкозо-6-фосфата 0,5 ед/мл, креатинкиназу. Следят за изменением оптической плотности: если изменения существенны, вносят 10 мМ АМФ для ингибирования адени-латкиназы, которая часто бывает в препаратах гексокиназы. Затем реакцию начинают добавлением креатинфосфата. Измеряют нарастание оптической плотности НАДФН при 340 нм.

Выделение и очистка креатинкиназы из скелетных мышц кролика

Реактивы:

1. КС1 — 0,01 М раствор, 0,3 М раствор.

2. NH4C1 — сухой, х. ч.

3. NaCl — сухой, технический.

4. NH4OH — 5 М раствор.

5. Этанол — 95—98%-ный, перегнанный.

6. Глицин-NaOH буфер — 0,01 М раствор, рН 9,0.

7. Трис-HCl буфер — 0,05 М раствор, рН 8,0.

8. ДЭАЭ-целлюлоза.

Все растворы готовят на бидистиллированной воде. Работу проводят при 0—4° С, посуду и растворы заранее охлаждают.

Экстракция. Измельченную мышечную массу в количестве 200— 300 г (приготовление см. на с. 221) заливают двойным объемом 0,01 М КС1, тщательно перемешивают, гомогенизируют в течение 3 мин с перерывами, следя за тем, чтобы смесь не нагревалась. Густой гомогенат перемешивают в течение 15 мин, затем фильтруют через 4 слоя влажной марли.

Очистка экстракта этанолом и тепловая денатурация балластных белков. Измерив объем фильтрата, помещают его в охлаждающую смесь (лед — NaCl), добавляют при постоянном перемешивании сухой NH4CI до конечной концентрации 0,1 М, затем доводят рН экстракта до 9,0, осторожно приливая 5 М NH4OH. Перемешивают 30 мин, добавляют 1,5 объема охлажденного до —10° С — (—20° С) этилового спирта. Спирт добавляют медленно, по каплям из делительной воронки, перемешивая экстракт и следя за тем, чтобы температура смеси не повышалась выше 0—2° С. Затем температуру смеси постепенно доводят на водяной бане до 20° С. Оставляют при этой температуре на 2—2,5 ч, постоянно перемешивая. Выпавший денатурированный белок удаляют центрифугированием в течение 30 мин при 1000 g. Центрифугат оставляют на ночь в холодильнике.

Осаждение креатинкиназы спиртом. Выпавший за ночь небольшой осадок удаляют центрифугированием при 1000 g в течение 30 мин. Из прозрачного центрифугата осаждают креатинкиназу, доводя концентрацию этанола до 70 об.%, тщательно следя за тем, чтобы температура смеси не поднималась выше 0—2° С. Осадок фермента собирают центрифугированием при 2000 g в течение 20 мин, растворяют в небольшом объеме 0,01 М глицин-NaOH буфера, рН 9,0 (или в 0,05 М трис-HCl буфере, рН 8,0).

Диализ. Раствор фермента диализуют лротив 0,01 М глицин-NaOH буфера, рН 9,0, в течение 48 ч с 4-кратной сменой буфера. Небольшой осадок, образовавшийся в мешочке для диализа, удаляют центрифугированием при 1000 g. Прозрачный центрифугат препарата фермента разливают по небольшим порциям, замораживают и хранят при — 10° С — (—20° С).

Ионообменная хроматография. Фермент, полученный вышеописанным методом, обладает 85—95%-ной чистотой. Для получения более гомогенного препарата проводят ионообменную хроматографию на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой (2x20 см), уравновешенной 0,05 М трис-HCl буфером, рН 8,6. Раствор белка предварительно диализуют против этого буфера в течение 12—16 ч. Креатинкиназа выходит в свободном объеме колонки при элюции этим же буфером, тогда как примеси связываются с ДЭАЭ-целлюлозой. На колонку можно наносить 70— 250 мг белка. Связавшиеся примеси удаляют пропусканием через колонку 0,2—0,3 М КС1 в том же буфере. Скорость тока жидкости через колонку — 0,5 мл/мин, объем каждой фракции — 3—4 мл. Фракции, содержащие креатинкиназу, хранят в замороженном состоянии.

ЛИТЕРАТУРА

1 Л ы з л о в а С. Н Фосфагенкиназы М, 1974.

2 Четверикова Е. П. и др Состав и кинетические свойства креатинкиназы из скелетных мышц//Биохимия 1970. Т. 35. С. 953.

3 Watts D. С. Kreatine Kmase//The Enzymes. N. У., 1973. Vol. 8. P. 383.

4 Bickerstaff G. F., Price N. C. Creatine Kinase: a reviw of recent works on the mechanism and subunit behavior of the enzyme//Intern. J. Biochem. 1978. Vol. 9. P. 1.

5. Kenyon G. L„ Reed G. H. Creatine Kinase — structure activity relation ships// //Adv. Enzymol. N. Y., 1983. Vol. 54. P

страница 150
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
mandelli ручки для межкомнатных дверей
флешки на день учителя
аренда микшера
вентилятор вркш-6,3-4 нижний новгород

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(03.12.2016)