химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

озетками и совочком из кальки.

9Q

Получение дрожжевого экстракта. 10 г высушенных дрожжей растирают в ступке с 30 мл бидистиллированной воды до получения однородной суспензии. Суспензию переливают в мерный цилиндр объемом 100 мл и помещают его в водяной термостат при 30° С. Содержимое цилиндра время от времени перемешивают стеклянной палочкой. Цилиндр оставляют в термостате до полного прекращения брожения углеводов, содержащихся в дрожжевых клетках. Об окончании бро

жения судят по прекращению выделения углекислого газа. Обычно процесс заканчивается за 1—2 ч.

По окончании брожения 12 суспензию дрожжей центрифугируют с охлаждением в течение 15—20 мин при 25 ООО g. Для освобождения дрожжевого экстракта от растворенного в нем углекислого газа центри-фугат помещают в колбу Бунзена, стоящую во льду, добавляют к нему 0,05 объема 3 М раствора ацетатного буфера (рН 5,0) и перемешивают. Колбу закрывают резиновой пробкой со вставленной в нее стеклянной трубочкой, доходящей почти до дна колбы, и через боковой отросток присоединяют на 15—20 мин к слабодействующему водоструйному насосу (рис. 3). Колбу время от времени встряхивают.

Дрожжевой экстракт готовят непосредственно перед опытом и хранят на льду13, используют как препарат пируват-декарбоксилазы.

Определение пировиноградной кислоты. К исследуемому раствору пировиноградной кислоты 14 приливают 0,1 объема ацетатного буфера (рН 5,0), к которому заранее добавляют 0,1 объема 0,5 М раствора КН2Р04. Перемешивают и 2 мл этого раствора помещают в основное пространство сосудика Варбурга (ставят не менее двух параллельных проб). В другие сосудики вносят по 2 мл бидистиллированной воды, подкисленной так же, как и исследуемый раствор (контрольные пробы). В боковые реторточки всех сосудиков помещают по 0,5 мл дрожжевого экстракта. Сосудики пришлифовывают к манометрам и погружают в термостатированную баню аппарата Варбурга, предварительно отрегулированную на 26° С. Краны манометров при этом должны быть открытыми, а сосудики полностью погружены в воду. Пускают качающий механизм. Через 5 мин (время, необходимое для выравнивания температуры) его останавливают, устанавливают жидкость в обоих коленах манометра на одном уровне (например, на уровне 100). Краны манометров закрывают и продолжают встряхивание, отмечая каждые 3 мин показания манометров до тех пор, пока выделение углекислого газа, не полностью удаленного из дрожжевого экстракта, станет небольшим и одинаковым в опытных и контрольных сосудиках.

12 Не следует держать суспензию дрожжей после прекращения брожения долго

в термостате, так как это снижает активность пируватдекарбоксилазы.

13 При добавлении 1/5; объема 90%-ного глицерина экстракт может храниться в

холодильнике в течение нескольких дней.

14 Раствор пировиноградной кислоты должен быть приготовлен с учетом величины константы прибора. Константа прибора — объем газа, приведенного к нормальным условиям, который должен выделиться или поглотиться в системе для смещения

жидкости в манометре на 1мм (с 12).

После этого краны манометров открывают для выравнивания давления в сосудиках, устанавливают уровень жидкости в правом колене манометра на делении 100, краны закрывают и записывают показание уровня жидкости левого (открытого) колена. Экстракт из боковой реторточки выливают в основное пространство сосудика и продолжают инкубацию, отмечая показания манометров через каждые 5 мин. Для

этого останавливают качающий механизм, при закрытых кранах доводят уровень жидкости в правом колене манометра до деления 100 и записывают показания левого колена манометра. Такие отсчеты делают до полного прекращения выделения С02. Реакция должна заканчиваться за 15—20 мин. Если через 20 мин выделение углекислого газа не прекратилось, это указывает на недостаточную активность дрожжевого экстракта 15. О количестве углекислого газа, выделившегося в процессе декарбоксилирования пировиноградной кислоты, судят по разности показаний манометров опытных и контрольных проб. В контрольных пробах регистрируется изменение давления, происходящее за счет неспецифического выделения С02, а также за счет колебания температуры в термостате и изменения барометрического давления. Рассчитывают содержание пировиноградной кислоты в исследуемой пробе, учитывая, что из 1 моля пировиноградной кислоты выделяется 1 моль С02 (т. е. при нормальных условиях 22,4 л).

ЭНЗИМАТИЧЕСКИЙ МЕТОД С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

Метод основан на энзиматическом восстановлении пировиноградной кислоты в молочную ферментом лактатдегидрогеназой при одновременном окислении НАДН. О количестве пировиноградной кислоты судят по убыли НАДН, измеряя уменьшение оптической плотности при 340 нм (с.7). Реакция сдвинута в сторону образования молочной кислоты при рН 7,4 и 22° С.

Реактивы

1. Калий-фосфатный буфер — 0,1 М раствор, рН 7,4.

2. НАДН — 3- 1СН5 М раствор, рН 7,4.

3. Лактатдегидрогеназа — 2 мг/мл (коммерческий препарат) или экстракт мышц 1:25 (получение экстракта мышц см. с. 28).

4. НСЮ4 — 0,5 н. раство

страница 15
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
билеты на сирано де бержерак
матрас indigo №1
дача в рассрочку на новорижском шоссе
раскладушка кантемировская

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(19.10.2017)