химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

ется к местам ее утилизации, где и происходит обратная реакция образования АТФ из креатинфосфата и АДФ с помощью цитоплазматических изоферментов.

Все цитоплазматические креатинкиназы обладают близкими молекулярными массами, коэффициентами седиментации. Они состоят из двух полипептидных цепей, молекулярная масса которых равна 40 000—43 ООО Да.

Митохондриальный фермент выделен в виде димера, гексамера и октамера. Изоферменты креатинкиназы различаются по электрофо-ретической подвижности, по кинетическим свойствам, по термостабильности, по аминокислотному составу, по количеству и реактивности SH-групп, аргининовых остатков и другим свойствам. Мышечный изо-фермент (ММ) более стабилен, чем мозговой (ВВ) и митохондриальный при изменении рН и температуры. Они устойчивы в диапазоне рН 6,0—9,5, но при этом к раствору мозгового и митохондриального изоферментов необходимо добавлять SH-восстанавливающие реагенты (2-меркаптоэтанол и др.). Оптимальные значения рН активности для изоферментов практически одинаковы и равны: 9 — для прямой реакции (синтеза креатинфосфата) и 7 — для обратной реакции (расщепления креатинфосфата).

Активаторами реакции являются Mg2+, Mn2n+, Са2+, Со2+; НСОз~\ HC02~, N03~, N02~, Cl~, Br-, F~ являются ингибиторами ферментов, так как занимают место фосфорильной группы, которая переносится в реакции трансфосфорилирования и образуют аналог комплекса переходного состояния (Е—Mg-АДФ—NO3""—креатин).

Величины кажущихся констант Михаэлиса для субстратов колеблются в зависимости от природы используемого буфера, рН, температуры, источника выделения фермента и прочих условий. Кажущиеся константы Михаэлиса цитоплазматических креатинкиназ равны: для Mg—АТФ—0,5—1,0 мМ; Mg—АДФ—0,2—0,8 мМ; для креатина — 16—20 мМ; для креатинфосфата — 4—8 мМ. Для митохондриальных креатинкиназ эти показатели равны: для Mg—АТФ—0,06—0,7 мМ; для Mg—АДФ—0,02—0,06 мМ; для креатина — 4—6 мМ; для креатинфосфата — 0,2—0,8 мМ.

ООО

Определение активности креатинкиназы

Химический метод

Активность определяют по начальной скорости обратной реакции:

креатинфосфат-}-Mg—АДФ ^креатин +Mg—АТФ.

Креатин, образующийся в реакции, определяют колориметрически после образования окрашенного комплекса с диацетилом в присутствии а-нафтола. Некоторые компоненты среды для определения активности (например, глицил-глициновый или трис-HCl буфер) влияют на интенсивность окраски и это необходимо учитывать при определении креатина и построения калибровочной кривой.

Реактивы:

1. Трис-HCl — 100 мМ раствор, рН 7,2.

2. Креатинфосфат — 100 мМ раствор.

3. АДФ — 10 мМ раствор, рН 7,0.

4. АМФ — 100 мМ раствор, рН 7,0.

5. а-нафтол — 1%-ный раствор.

6. Диацетил — 0,05%-ный раствор.

7. Mg(CH3COO)2 — 100 мМ раствор.

8. Креатинкнназа — 2 мг/мл. В 50 мМ растворе трис-HCl буфера (рН 7,2) хранят в замороженном состоянии, перед определением активности однократно размораживают и разводят тем же

буфером.

В реакционную смесь объемом 5 мл добавляют компоненты ферментативной реакции в конечной концентрации: 50 мМ трис-НС1, рН 7,2; 10 мМ креатинфосфат; 10 мМ АМФ, 5 мМ Mg(CH3COO)2, раствор креатинкиназы. Если в препарате фермента отсутствует примесь аденилаткиназы, АМФ в реакционную смесь не добавляют. Смесь выдерживают 5 мин при 30° С, после чего реакцию запускают добавлением АДФ (1 мМ), быстро перемешивают и затем каждые 2—3 мин отбирают по 0,5 мл раствора. Пробы помещают в заранее приготовленную смесь, состоящую из 1 мл 1%-ного щелочного раствора а-нафтола и 0,5 мл 0,05%-ного раствора диацетила. Каждую пробу после доведения ее объема до 5 мл через 30 мин колориметрируют при 540 нм. Первая проба (взятая в течение первых 20 с) может служить контрольной, но лучше ее готовить без добавления АДФ.

Энзиматичес к ие методы

А. По нарастанию образующего АДФ в прямой реакции

Концентрацию АДФ измеряют в сопряженной с пируваткиназой и лактатдегидрогеназой системе по количеству образовавшегося НАД по следующей схеме:

креатин + АТФ

креатинкнназа ^ Д Дф + креатинфосфат

фосфоенолпируват

пируваткиназа

пируват

АТФ

лактатдегидрогеназа

ч- НАДН + Н+ ->НАД+

лактат

Реактивы:

1. Глицил-глициновый буфер — 150 мМ раствор, рН 7,0.

2. Креатин — 75 мМ раствор.

3. АТФ — 50 мМ раствор, рН 7,0.

4. Mg(CH3COO)2 — 100 мМ раствор.

5. Фосфоенолпируват — 15 мМ раствор, рН 7,5.

6. НАДН — 3 мМ раствор, рН 7,5.

7. Пируваткиназу, лактатдегидрогеназу и креатинкиназу растворяют в 50 мМ глицил-глициновом буфере, рН 8,0.

8 Дитиотреитол — 30 мМ раствор.

В спектрофотометрическую кювету вносят следующие компоненты реакции (указаны конечные концентрации): 50 мМ глицил-глициновый буфер. рН 8,0; 25 мМ креатин; 5 мМ АТФ; 10 мМ Mg(CH3COO )2; 0,1 мМ НАДН; 0,5 мМ фосфоенолпируват; 0,2—1 мМ дитиотреитол, пируваткиназу 0,4 ед/мл, лактатдегидвогеиазу 0,4 ед/мл. Реакцию начинают добавлением креатинкиназы. Измеряют уменьшение оптической плотности НАДН при 340 нм.

Б. По нарастанию образующегося АТФ в обратной реакции

Концентрацию АТФ измеряют в сопряженной эн

страница 149
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
купить meizu в кредит
Asus GL502VS
afisha ru григорий лепс крокус сити
средства для ухода за линзами

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(20.10.2017)