химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

насыщения 0,5. Перемешивают 15 мин, центрифугируют 10 мин при 40 000 g и осадок отбрасывают. К центрифугату добавляют еще насыщенный раствор сульфата аммония (рН 8,5) до насыщения 0,75. Перемешивают 30 мин, центрифугируют 15 мин при 40 000 g, центрифугат отбрасывают; осадок растворяют в минимальном объеме 0,05 М трис-HCl буфера (рН 8,5).

Гель-фильтрация на сефадексе G-200. На колонку с сефадексом G-200 (1,5x50 см), уравновешенным 0,05 М трис-HCl буфером (рН 8,5), наносят ферментный раствор, полученный на предыдущей стадии. Элюцию белка осуществляют тем же буфером, собирая фракции по 2,5 мл со скоростью 3—4 мл/ч. Фракции элюата, содержащие транскетолазную активность, объединяют и хранят в замороженном состоянии при —16° С.

Определение активности

По убыли восстановленного НАД

Принцип метода, реактивы и ход работы те же, что указаны на с. 279, только в данном случае в реакционную смесь дополнительно добавляют 5 мМ ЭДТА, а вместо глицил-глицинового буфера — 0,05 М тризтаноламиновый буфер (указаны конечные концентрации), и не добавляют тиаминпирофосфат и хлористый магний.

По скорости восстановления НАД

Принцип метода, реактивы и ход работы те же, что указаны на с. 281, только из реакционной смеси исключают тиаминпирофосфат и хлористый магний.

По количеству образующегося седогептул озо-7-фосфата

Реактивы:

1. Триэтаноламиновый буфер — 0,04 М раствор, рН 7,8.

2. Раствор фосфопентоз (с. 282).

3. Транскетолаза — около 0,6 Е фермента в 1 мл.

4. Трихлоруксусная кислота — 5%-ный раствор.

5. Реактивы для определения седогептулозо-7-фосфата (с. 282).

Процедура определения активности описана на с. 282, только вместо глицил-глицинового буфера берут триэтаноламиновый буфер. Добавление хлористого магния и тиаминпирофосфата в данном случае не требуется.

ЛИТЕРАТУРА

1. Кочетов Г. А. Транскетолаза: структура н механизм действия//Биохимия. 1986. Т. 51. Вып. 12. С. 2010.

2. Р h i 1 i р р о v P. P. et al. Characterization and properties of pig liver transketolase// //Biochem. Biophys. acta. 1980. Vol. 613. P. 359.

18. ПОЛУЧЕНИЕ ФОСФОПЕНТОЗ

Смесь фосфопентоз, содержащую рибозо-5-фосфат, ксилулозо-5-фосфат и рибозо-5-фосфат, получают энзиматически из рибозо-5-фос-фата. В качестве ферментного препарата используют смесь рибозофос-фатизомеразы и рибулозофосфат-3-эпимеразы. Под действием указанных ферментов в системе устанавливается следующее равновесие_ рибозофосфатизомераза

рибозо-5-фосфат < —* рибулозо-5-фосфат^:

рнбулозофосфятЗ-эпнмераза _

_х ». КСНЛуЛОзо-5-фосфат.

Образовавшуюся смесь фосфопентоз выделяют в виде бариевой соли.

Получение ферментного препарата

Реактивы:

1. Двузамещенный фосфат натрия — Ьб мМ раствор.

2. КОН — 2 н. раствор.

3. Ацетон, х. ч.

4. Ацетон технический.

5. Сухой лед.

6. Сульфат аммония, сухой.

7 Сульфат аммония — полунасыщенный раствор.

Ферментный препарат выделяют из пекарских дрожжей. Первоначальная процедура очистки, включая диализ осадка после обработки ацетоном, совпадает с той, которая используется при выделении транскетолазы (с. 283). Затем проводят следующие стадии обработки.

Тепловая обработка. Отдиализованный раствор ацетоновой фракции центрифугируют 5 мин при 25 000 g и осадок отбрасывают. Центрифугат разводят пятью объемами воды, предварительно нагретой до 60°С, нагревают на кипящей водяной бане до 60° С и помещают на 25 мин в водяной термостат при 60° С. Охлаждают в сосуде с тающим льдом и центрифугируют 5 мин при 18 000 jg". Осадок отбрасывают.

Фракционирование сульфатом аммония. К центрифугату предыдущей стадии добавляют при помешивании сульфат аммония из расчета 29 г на каждые 100 мл раствора. Через 20 мин центрифугируют 10 мин при 40 000 g. Осадок отбрасывают, а к центрифугату добавляют сульфат аммония — 16,7 г на каждые 100 мл раствора. Через 30 мин центрифугируют при 40 000 g в течение 10 мин. Центрифугат отбрасывают, а осадок растворяют в" 50 мл холодной воды. Добавляют сульфат аммония до 80%-ного насыщения и 2 М раствор КОН до рН 7,6. Оставляют при перемешивании на 30 мин, после чего центрифугируют 10 мин при 40 000 g. Центрифугат отбрасывают, а осадок растворяют в 50 мл холодной воды.

Осаждение сульфатом аммония повторяют еще 2—3 раза, после чего осадок суспендируют в 30 мл полунасыщенного раствора сульфата аммония. В таком виде ферментный препарат стабилен в течение нескольких недель при его хранении в холодильнике.

Получение смеси фосфопентоз

Реактивы:1. Свежеприготовленный раствор аммонийной соли рибозо-5-фос-фата. К 1,25 г бариевой соли рибозо-5-фосфата добавляют 12,5 мл 0,1 н. соляной кислоты и помещают на 4 мин в кипящую водяную баню. После охлаждения удаляют барий с помощью раствора сульфата аммония; добавляют раствор гидро^ окиси аммония до рН 7,6 и воду до конечного объема 20 мл.

2. Свежеприготовленный раствор ферментного препарата, содержащего рибозофосфатизомеразу и рибулозофосфат-3-эпимеразу. 12 мл суспензии ферментного препарата (с. 288) центрифугируют 15 мин при 40 000 g. Центрифугат отбрасывают,

страница 146
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
паровой калорифер кпск 4-11фото
цены на ванну
подставки под аппаратуру
биокамин валенсия

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(24.01.2017)