химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

пределяют белок и тран-скетолазную активность. Основное количество фермента обычно обнаруживается во фракции насыщения 0,59—0,64.

Кристаллизация. При комнатной температуре к раствору сульфатно-аммонийной фракции, содержащей основное количество фермента, добавляют при помешивании насыщенный раствор сульфата аммония (рН 7,6) до слабого помутнения. Через 30—40 мин фермент переносят в холодильник.

В таком виде фермент может храниться длительное время без потери своих каталитических свойств. Для работы используют суспензию транскетолазы (не центрифугируя), так как фермент относительно равномерно распределен между осадком и маточным раствором.

ТРАНСЖЫ ил АЗА П<5 1Ш4СНП ^OKirlDKl

Фермент имеет молекулярный вес порядка 150 ООО Да и субъединичную структуру типа агр2- Молекулярная масса а-субъединиц — около 50 ООО Да, р-субъединиц — около 25 ООО Да.

Препараты транскетолазы выделяются из печени свиньи в виде холофермента, отделить от него тиаминпирофосфат не удается.

Оптическая плотность для раствора фермента, содержащего 1 мг/мл, при 280 нм равна г-,24. Оптимум каталитического действия лежит при рН 7,8.

Выделение фермента

Реактивы:

1. Ацетон.

2. Карбонат натрия — 15 мМ раствор.

3. Протаминсульфат.

4. ДЭАЭ-целлюлоза, уравновешенная 2 мМ калий-фосфатным буфером, рН 7,6 (с. 109).

5. ДЭАЭ-сефадекс Л-25, уравновешенный 0,02 М трис-HCl буфером, рН 9,2 (с. 109).

6. Сефадекс G-200, уравновешенный 0,05 М трис-HCl буфером, рН 8,5 (с. 109).

7. Трис-HCl буфер — 0,05 М раствор, рН 8,5.

8. КС1 — 0,1 М и 0,02 М растворы.

9. Сульфат аммония, сухой.

10. Сульфат аммония — насыщенный раствор, рН 8,5.

Приготовление исходного препарата. Печень свиньи транспортируют в лабораторию во льду. Освобождают от крупных сосудов, заливают 4-кратным объемом предварительно охлажденного до —20° С ацетона и гомогенизируют в течение 2 мин. Быстро фильтруют на холоде с отсасыванием. Фильтрат отбрасывают, осадок повторно обрабатывают ацетоном, как указано выше, и измельчают вручную при комнатной температуре. Полученный порошок хранят в вакуум-эксикаторе в холодильнике.

Экстракция. 15 г препарата в виде ацетонового порошка заливают 150 мл 15 мМ раствора карбоната натрия и оставляют при перемешивании на 45 мин при комнатной температуре. Центрифугируют 10 мин в рефрижераторной центрифуге при 40 000 g. Осадок отбрасывают, рН центрифугата доводят до 8,0. Полученный экстракт может храниться в холодильнике в течение суток без потери активности.

Вся последующая работа проводится в холодной комнате.

Обработка протаминсульфатом. К тканевому экстракту медленно, при помешивании, добавляют протаминсульфат из расчета 1 г на 20 г белка (рассчитанную навеску протаминсульфата предварительно растворяют в минимальном объеме бидисдиллированной воды). Перемешивают в течение 10 мин, после чего центрифугируют 15 мин при 40 000 g и осадок отбрасывают.

Обработка ДЭАЭ-целлюлозой. ДЭАЭ-целлюлозу предварительно уравновешивают 2 мМ калий-фосфатным буфером (рН 7,6) и отжимают на бухнеровской воронке. Порцию отжатого осадка добавляют к центрифугату, полученному на предыдущей стадии (в соотношении приблизительно 1:5), и перемешивают 10—15 мин. Центрифугируют и man при uuu g, осадок оторасывают, центрифугат еще раз обрабатывают ДЭАЭ-целлюлозой в соотношении 1 : 15. Аналогичную обработку повторяют до тех пор, пока концентрация белка в ферментном растворе не снизится до 6—8 мг/мл. На данной стадии ферментный раствор может храниться в замороженном состоянии в течение нескольких недель без потери транскетолазной активности.

Первое фракционирование сульфатом аммония. К ферментному раствору, полученному на предыдущей стадии, добавляют порошок сульфата аммония до насыщения 0,5. Раствор перемешивают 15 мин, после чего центрифугируют 15 мин при 40 000 g. Осадок отбрасывают, к центрифугату добавляют еще сульфат аммония до насыщения 0,75, перемешивают 15 мин, затем снова центрифугируют при тех же условиях. Центрифугат отбрасывают, осадок растворяют в 15 мл 0,05 М трис-HCl буфера (рН 8,5). В замороженном виде полученный раствор может храниться в течение суток без потери транскетолазной активности.

Хроматография на ДЭАЭ-сефадексе А-25. Через колонку с подвижным адаптером с ДЭАЭ-сефадексом А-25 (5X26 см), уравновешенную 0,02 М трис-HCl буфером (рН 9,2), пропускают последовательно (снизу вверх) 1 л 0,02 М раствора хлористого калия и ферментный раствор, полученный на предыдущей стадии. Как только ферментный раствор полностью впитывается, начинают пропускать 0,1 М хлористый калий, который используется в качестве элюирующего раствора. Скорость элюции — 90 мл/ч, объем элюируемых фракций — 3 мл. Во фракциях определяют белок и транскетолазную активность. Фракции с удельной активностью 0,1 Е/мг и выше объединяют и используют для дальнейшей работы (можно хранить в холодильнике в течение ночи).

Второе фракционирование сульфатом аммония. К ферментному раствору, полученному на предыдущей стадии, добавляют насыщенный раствор сульфата аммония (рН 8,5) до

страница 145
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
обучение корел драу
Система хранения с выдвижными ящиками RB 0304-4 GC
сколько стоят курсы массажиста
комплект nema1-m2 для fc-051 1.5 квт

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(05.12.2016)