химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

ре или помещают на 2 ч в водяной термостат при 60° С. Развившаяся окраска стабильна в течение нескольких часов. Пробы фотометрируют (опытные пробы против контрольных) при 510 и 540 нм.

Для построения калибровочной кривой стандартный раствор ангидрида седогептулозы наливают в пробирки по 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 и 0,5 мл соответственно. Объем доводят водой до 0,5 мл и затем обрабатывают, как указано выше.

При расчете берут разницу величин оптической плотности при 510 и 540 нм.

Выделение фермента из дрожжей

Реактивы:

1. Двузамещенный фосфат натрия — 66 мМ раствор.

2. Калий-фосфатный буфер — 5 мМ раствор, рН 7,7.

3. КОН — 3 н. и 1 н. растворы

4. Ацетон, х. ч.

5. Ацетон технический

6. Этиловый спирт.

7. Сухой лед.

8. Сульфат аммония, сухой.

9. Сульфат аммония, насыщенный раствор, доведенный аммиаком до рН 7,6.

10. ДЭАЭ-целлюлоза, уравновешенная 5 мМ калий-фосфатным

буфером, рН 7,7 (с. 109).

Подготовка исходного материала. Свежие пекарские дрожжи сушат в токе теплого воздуха. В герметически закрытой посуде высушенные дрожжи могут храниться в холодильнике около года. Выделение фермента, где это специально не оговаривается, проводят в холодной комнате.

Экстракция. 300 г сухих дрожжей заливают 900 мл 66 мМ раствора двузамещенного фосфата натрия и помещают при периодическом перемешивании в водяной термостат при 40° С на 2,5 ч. Центрифугируют 20 мин при 18 000 g и осадок отбрасывают.

Фракционирование ацетоном. Стакан с центрифугатом, полученным на предыдущей стадии, помещают в ацетоновую баню при минус 4 — минус 6° С. Добавляют при перемешивании ацетон в количестве 1/2 объема центрифугата, предварительно охлажденный до 0 — минус 2° С (температура в стакане при приливании ацетона должна быть около —2° С). Затем раствор перемешивают еще 1—2 мин, после чего центрифугируют при —2° С 5 мин (18 0,00 g) и осадок отбрасывают. К центрифугату при тех же условиях, что и в первый раз, добавляют такое же количество ацетона. Осадок собирают центрифугированием, размешивают с 100 мл холодной бидистиллированной воды и ставят на ночь на диализ против 50 объемов бидистиллированной воды. Центрифугируют 5 мин при 18 000 g и осадок отбрасывают.

Тепловая обработка. Центрифугат предыдущей стадии разливают в длинные тонкостенные химические пробирки и помещают в водяной термостат при 55° С на 15 мин. Затем центрифугируют 10 мин при 18 000 g и осадок отбрасывают

*~ v-iuivuu ^ и,сп 1 pinjpyi атом

помещают в ацетоновую баню при минус 2 — минус 4° С. Раствор перемешивают до тех пор, пока его температура не снизится до 0° Сг после чего при перемешивании начинают добавлять этанол, предварительно охлажденный до —8° С (—10° С). Понижением температуры в ацетоновой бане с помощью сухого льда добиваются того, что температура в стакане постепенно снижается до —6° С

После того как весь этанол добавлен (0,5 объема по отношению к объему ферментного раствора), раствор перемешивают еще 5 мин,, после чего центрифугируют при —6°С в течение 10 мин (18 000 g). Центрифугат отбрасывают, осадок размешивают при комнатной температуре в 6—10 мл воды и центрифугируют повторно при 2—4° С в течение 10 мин (40 000 g). Осадок отбрасывают. На этой стадии ферментный раствор может храниться 3—4 дня в холодной комнате или 10—12 дней при —16° С без потери ферментативной активности. Перед, использованием для дальнейшей очистки его центрифугируют, как указано выше, и осадок отбрасывают.

Хроматографирование на ДЭАЭ-целлюлозе. Часть центрифугата предыдущей стадии (400—500 мг белка) наносят на колонку ДЭАЭ-целлюлозы (3,0X5,5 см), уравновешенную 5 мМ калий-фосфатным буфером, рН 7,7. Такой же буфер используют и для элюции, собирая фракции по 5 мл со скоростью 1 мл/мин. Определяют в них белок и транскетолазную активность. Фракции с высокой удельной активностью объединяют, остальные отбрасывают.

Фракционирование сульфатом аммония. К ферментному раствору добавляют при перемешивании сульфат аммония из расчета 2,9 г на каждые 10 мл. Добавлением 1 М раствора калиевой щелочи доводят рН до 7,6 и оставляют при перемешивании на 15 мин. Если выпадает осадок, его удаляют центрифугированием при 40 000 g в течение 5 мин. К центрифугату при комнатной температуре добавляют еще сульфат аммония (1,3 г на каждые 10 мл раствора) и через 30 мин центрифугируют 15 мин при 40 000 g. Центрифугат отбрасывают, осадок растворяют в 5 мМ фосфатном буфере (рН 7,7) до получения конечной концентрации белка, равной 2 мг/мл. К полученному раствору добавляют сухой сульфат аммония до насыщения 0,5, и если выпал осадок, центрифугируют 5 мин при 40 000 g. Осадок отбрасывают, к центрифугату добавляют КОН до рН 7,6 и затем насыщенный раствор сульфата аммония (рН 7,6) до насыщения 0,55. Через 15 мин центрифугируют при 40 000 g в течение 10 мин.

Аналогичным образом получают последовательно сульфатно-аммонийные фракции насыщения 0,55—0,59; 0,59—0,64; 0,64—0,70 соответственно. Осадки растворяют в минимальном объеме 5 мМ фосфатного-буфера (рН 7,6) и в полученных растворах о

страница 144
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
юридическая консультация по ипотеке
Seiko QHE089K
grundfos tp 80 150 4
Дом в поселке Довиль, 775 кв. м.

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(22.01.2017)