химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

° С.

7. Транскетолаза — препарат фермента разводят 0,05 М глицил-глициновым буфером (рН 7,6) таким образом, чтобы при добавлении в реакционную смесь 0,1 мл полученного раствора изменение оптической плотности при 340 нм составляло бы около 0,04 в 1 мин.

В спектрофотометрическую кювету помещают реакционную смесь следующего состава (указаны конечные концентрации): 25 мМ глидил-глициновый буфер, 0,1 мМ НАД восстановленный, вспомогательные ферменты (1,5—3 мг белка на пробу), фосфопентозы (5 мг на пробу), 0,1 мМ тиаминпирофосфат, ЗмМ хлористый магний. Реакцию начинают добавлением разведенного соответствующим образом раствора транскетолазы. Общий объем пробы — 3 мл. Контрольная кювета не содержит исследуемого фермента

Изменение оптической плотности измеряют в течение 5 мин с одноминутными интервалами.

Б По скорости восстановления НАД

В данном случае в качестве вспомогательного фермента используется глицеральдегидфосфатдегидрогеназа и транскетолазную активность измеряют по количеству восстановленного НАД, образующегося при окислении одного из продуктов транскетолазной реакции — фос-фоглицеринового альдегида:

хсилуяозо-5-фосфат седогептулозо-7-фосфат

^^^^ транскетолаза

рибозо 5 фосфат пицеральдегид-З-фосфат

фосфоглицериновая кислота +НАДН -Н1+

За ходом процесса следят спектрофотометрически по увеличению оптической плотности при 340 нм (см с 7) На 1 моль вступившего в реакцию субстрата образуется I моль восстановленного НАД.

Реактивы:

1. Глицил-глициновый буфер (рН 7,6) — 0,5 и 0,05 М растворы. 2 НАД — 6 мМ раствор, рН 6,0 В холодильнике может храниться несколько дней.

3. Хлористый магний — 0,06 М раствор

4. Арсенат натрия — 0,5 М раствор.

5 Тиаминпирофосфат — 3 мМ раствор В холодильнике может храниться несколько дней.

6 Цистеин — 0,01 М раствор, рН 7,6 (свежеприготовленный)

7 Глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа — 76 Е/мл Фермент не должен содержать триозофосфатизомеразу, выделяется из мышц кролика (с. 253).

8. Раствор фосфопентоз (с. 280).

9. Транскетолаза (с. 280).

8 спектрофотометрическую кювету помещают реакционную смесь следующего состава (указаны конечные концентрации): 25 мМ глицил-глициновый буфер (рН 7,6), 0,3 мМ НАД, глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа — 5 Е на пробу, 3 мМ хлористый магний, 5 мМ арсе_ j,vTyvY«i, ^fivnTv ^^.[еин, фасфопентозы — 5 мг

на пробу. Реакцию начинают добавлением соответствующим образом разведенного раствора транскетолазы. Общий объем пробы — 3 мл. Контрольная кювета не содержит исследуемого фермента.

Изменение оптической плотности измеряют в течение 5 мин с одноминутными интервалами.

В. П о количеству образующегося с ед о г е п т у л о з о-7-фосфата

Одним из продуктов транскетолазной реакции является седогеп-тулозо-7-фосфат (при использовании в качестве субстратов ксилулозо-5-фосфата и рибозо-5-фосфата). Определяя его количество, можно судить о каталитической активности фермента. Седогептулозо-7-фосфат определяют по цветной реакции с цистеином в присутствии серной кислоты.

Реактивы:

1. Глицил-глициновый буфер — 0,5 и 0,05 М растворы, рН 7,6.

2. Хлористый магний — 0,06 М раствор.

3. Тиаминпирофос(фат — 2,8 мМ раствор. В холодильнике может храниться несколько дней.

4. Фосфопентозы — раствор, 50 мг/мл (в пересчете на бариевую соль). Приготовление см. на с. 280.

5. Транскетолаза — около 0,6 Е/мл. Исходный препарат фермента разводят до требуемой концентрации 0,05 М глицил-глициновым буфером (рН 7,6).

6. Трихлоруксусная кислота — 5%-ный раствор.

7. Реактивы для определения седогептулозо-7-фосфата:

а) серная кислота — раствор, содержащий шесть объемов концентрированной кислоты и один объем дистиллированной

воды;

б) солянокислый цистеин — свежеприготовленный 3%-ный

раствор;

в) ангидрид седогептулозы — стандартный раствор, 0,4 мМ.

В химические пробирки, стоящие во льду, помещают смесь: 0,35 М глицил-глициновый буфер, 4 мМ хлористый магний, 0,2 мМ тиамин-пирофосфат (указаны конечные концентрации), 0,06 Е транскетолазы. Общий объем смеси — 0,7 мл. Содержимое пробирок перемешивают и через 5—10 мин добавляют по 0,1 мл раствора фосфопентоз. Повторно перемешивают, отбирают по 0,1 мл и выливают в пробирки, содержащие по 0,4 мл 5%-ной трихлоруксусной кислоты (пробы до инкубации).

Пробирки с реакционной смесью вынимают изо льда и помещают в водяной термостат при 37° С. Через 5, 10, 15 и 20 мин отбирают из инкубационной смеси по 0,1 мл и переносят в пробирки, содержащие по 0,4 мл 5%-ной трихлоруксусной кислоты.

Пробы помещают в воду с толченым льдом (в качестве контроля ставят пробы, содержащие вместо исследуемого раствора 0,5 мл дистиллированной воды) и добавляют к ним по 2,5 мл раствора серной кислоты. Тщательно перемешивают и переносят в кипящую водяную баню на 3 мин (следят за тем, чтобы вода при этом не переставала кипеть). Затем штатив с пробирками переносят в толченый лед и в каждую добавляют по 0,05 мл раствора солянокислого цистеина. 1ща-тельно перемешивают и оставляют на 18 ч при комнатной температу

страница 143
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
ручки для мебели фото
купить дачу по новой риге от 50-60
бен-студио
почасовая аренда машин с водителем москва

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(04.12.2016)