химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

но, при перемешивании, добавляют сульфат аммония из расчета 3,6 г на каждые 10 мл. Через 20 мин после окончания добавления центрифугируют 15 мин при 40 000 g, осадок растворяют в 15—20 мл холодной воды, добавляют сульфат аммония в количестве 2 г на каждые 10 мл и центрифугируют 10 мин при 40 000 g. Осадок отбрасывают, к центрифугату медленно, при осторожном перемешивании, в течение нескольких часов добавляют сульфат аммония до насыщения 0,6.

Перекристаллизация. Суспензию кристаллов центрифугируют 15 мин при 40 000 g, осадок растворяют в минимальном объеме холодной воды и медленно, при перемешивании, добавляют насыщенный раствор сульфата аммония до насыщения 0,4—0,5. Через 30—40 мин после окончания добавления центрифугируют 15 мин при 40 000 g, осадок суспендируют в минимальном объеме раствора сульфата аммония насыщением 0,5 и хранят в холодильнике.

ЛИТЕРАТУРА

1. Sytkowski A. I. Metal Stoichimetry, Coenzyme Binding, and Zinc and Cobalt Exchange in Highly Purified Yeast Alcohol Dehydrogenase//Arch. Biochem. Biophys. 1977. Vol. 184. P. 505.

2. Sund H., Theorell H. Alcohol Dehydrogenases//The Enzymes. N. Y., 1963. Vol. 7. P. 25.

3. Branden G. I., Jornvall H., Eklund H. et al. Alcohol Dehydrogenases// //The Enzymes. N. Y., 1975. Vol. 11. P. 104.

17. ТРАНСКЕТОЛАЗА

(0~седогептулозо-7-фосфат: D-глицеральдегид-З-фосфат-гликольальдегидтрансфераза, КФ 2.2.1.1)

Транскетолаза — фермент пентозного пути превращения углеводов — катализирует обратимый перенос двууглеродного остатка с ке-тосахаров на альдосахара:

СН2ОН СНаОН

! !

со со

HOCH +НСО -тра" -> НСО +HOCH

II Ml

неон неон неон неон

II 11

R' R" R' R"

Субстратами-донорами двууглеродного остатка являются: ксилу-лозо-5-фосфат, фруктозо-6-фоофат, седогептулозо-7-фосфат и др. Функцию субстратов-акцепторов выполняют: />рибозо-5-фосфат, D-глицеральдегид-3-фосфат, 1)-эритрозо-4-фосфат и др.

Транскетолаза является тиаминовым ферментом. Относится к классу трансфераз. Обнаружена во всех исследованных органах и тканях животных, а также в растениях и у микроорганизмов.

ТРАНСКЕТОЛАЗА ИЗ ПЕКАРСКИХ ДРОЖЖЕЙ

Молекулярная масса фермента — 159 000 Да. Молекула состоит из двух субъединиц; диссоциация на субъединицы происходит при понижении концентрации белка в растворе.

Молекула транскетолазы имеет два активных центра, характеризующихся различным сродством к тиаминпирофосфату. Соответствующие величины Km (в присутствии кальция) равны приблизительно 3,2- Ю~8 и 2,5-10~7 М.

В процессе выделения фермента из дрожжей происходит частичное отщепление от него тиаминпирофосфата. Полное отделение можно получить, выдерживая фермент в щелочной среде (рН 8,0) или путем диализа против раствора ЭДТА. Взаимодействие кофермента с апо-«ферментом осуществляется при участии ионов двухвалентных металлов, таких как Mg2+, Са2+, Мп2+ и др. В нативной холотранскетолазе обнаружен только кальций в количестве 2 г-атом на моль белка.

Оптимум рН действия фермента — 7,6. Величины Km для рибозо-5-фосфата и ксилулозо-5-фосфата равны соответственно 4>10~4 и 2,Ы0-4 М. Оптическая плотность для раствора транскетолазы, содержащего в 1 мл 1 мг белка, при 280 нм равна 1,45.

Кристаллический фермент при хранении его в растворе сульфата аммония 50%-ного насыщения стабилен на холоде в течение нескольких месяцев.

Определение активности транскетолазы

А. По убыли восстановленной формы НАД

Используя вспомогательные ферменты — триозофосфатизомеразу и глицерол-3-фосфатдегидрогеназу, за ходом транскетолазной реакции можно следить спектрофотометрически' по убыли восстановленного НАД.

Последовательность реакций такова:

ксилулозо5-фосфат

седогептулозо-7-фосфат

транскетотаза

рибозо 5 фосфат

глицеральдегид-З-фосфат

диоксиацетонфосфат

НАДН+Н+

глицерол 3 фосфатдегидрогеназэ

глицерофосфат + НАД+

Таким образом, количество молей восстановленной формы НАД, вступившей в реакцию, равно количеству молей глицеральдегид-3-фос-фата, образовавшегося под действием транскетолазы. Убыль восстановленного НАД определяют спектрофотометрически по уменьшению» величины оптической плотности при 340 нм (с. 7).

Реактивы:

1. Глицил-глициновый буфер (рН 7,6) — 0,5 М и 0,05 М растворы.

2. Восстановленный НАД — 2 мМ раствор, рН 8,0. На холоде может храниться несколько дней.

3. Фосфопентозы — раствор, 25 мг/мл (в пересчете на бариевую соль). Используется в качестве субстрата транскетолазной реакции. Смесь фосфопентоз получают в виде бариевой соли (с. 287). Перед использованием ее переводят в калиевую соль и рН раствора доводят до 6,5. В таком виде раствор можно хранить несколько дней при —16° С.

4. Тиаминпирофосфат — 3 мМ. В холодильнике может храниться несколько дней.

5. Хлористый магний — 0,06 М.

6. Сульфатно-аммонийная фракция, содержащая триозофосфат-изомеразу и глицерол-3-фосфатдегидрогеназу (получение см на с. 290). Для использования ее растворяют в бидистиллированной воде до получения концентрации белка, равной 50— 100 мг/мл. Может несколько дней храниться при —16

страница 142
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
блок компрессорно-конденсаторный ned nca 16 s/z цена

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(20.02.2017)