химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

диняют и добавляют к ним ЭДТА до конечной концентрации 1 мМ и мелкоиз-мельченный сульфат аммония для кристаллизации.

ЛИТЕРАТУРА

1. Уилкинсон Дж. Изоферменты М., 1968.

2. Schwert G., Winer A. Lactate dehydrogenase//The Enzymes. N. Y.; L., 1963. Vol. 7. P. 127.

3. E verse A., Kaplan N. O. Lactate dehydrogenase//Adv. in Enzymology and Related Areas of Molec. Biol. San Francisco. 1973. Vol. 11. P. 61.

4. Adams M. J., Buehner M, Chandrasekhar K. et all. Structure-function relationships in lactate dehydrogenase//Proc, Nat. Acad. Sci. USA. 1973. Vol. 70. P. 1968.

5. Ashmarina L. I., Muronetz V. I., Nagradova N. K. Lactate dehydrogenase can function in a monomeric form. The principles of an active subunit preparation// //Biochem. Int. 1981. Vol. 3. P. 415.

16. АЛКОГОЛЬДЕГИДРОГЕНАЗА

(Алкоголь: НАД-оксидоредуктаза, КФ 1.1.1.1)

Алкогольдегидрогеназа катализирует конечную реакцию брожения — восстановление (обратимое) уксусного альдегида в этиловый спирт:

СН3СНО + НАДН + Н+ ""°гольдег,",РОге1Ма->- СН3СН2ОН + НАД"1".

Фермент относится к классу оксидоредуктаз. Обнаружен во многих тканях животных и растений, а также у микроорганизмов.

Алкогольдегидрогеназа пекарских дрожжей энергично окисляет первичные спирты с неразветвленной цепью и со значительно меньшей скоростью спирты с разветвленной цепью, вторичные спирты, некоторые оксикислоты, аминоспирты и полиспирты. Молекула фермента (молекулярная масса около 150 000) состоит из четырех субъединиц, имеет четыре активных центра, содержит четыре атома прочно связанного цинка. Алкогольдегидрогеназа является сульфгидрильным ферментом. В трис- и пирофосфатном буферах оптимум рН равен 8,6. Кт для НАД и НАДН равны соответственно 1,7х10~4 М и 2,Зх10-5М, для этилового спирта — 1,6 X Ю-2 М, для уксусного альдегида — ЗХЮ"4 М. AioVm при 280 нм равна 12,6.

Определение активности алкогольдегидрогеназы

Окисление этилового спирта под действием алкогольдегидрогеназы сопровождается восстановлением НАД (моль на моль), что регистрируют спектрофотометрически по увеличению оптической плотности при 340 нм (с. 7).

Реактивы:

1. Натрий-пирофосфатный буфер — 60 мМ раствор, рН 8,5.

2. Этанол — 3 М раствор.

3. НАД — 15 мМ раствор, рН 6,0. Может несколько дней храниться на холоде.

4. Калий-фосфатный буфер — 10 мМ раствор, рН 7,5.

5. Бычий сывороточный альбумин, 0,1%-ный раствор, приготовленный на 10 мМ калий-фосфатном буфере, рН 7,5.

6. Алкогольдегидрогеназа — 1 Е/мл, свежеприготовленный раствор на 0,1%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина в 10 мМ калий-фосфатном буфере, рН 7,5.

В спектрофотометрическую кювету помещают реакционную смесь, содержащую (указаны конечные концентрации) *6 мМ буфер, 100 мМ этанол и 0,5 мМ НАД. Реакцию начинают добавлением 0,05 мл раствора алкогольдегидрогеназы. Общий объем пробы — 3 мл. Перемешивают и измеряют увеличение оптической плотности при 340 нм в течение 45 с. Состав контрольной кюветы тот же, только отсутствует субстрат.

Выделение алкогольдегидрогеназы из пекарских дрожжей

Реактивы: *'

1. Двузамещенный фосфат натрия — 66 мМ раствор.

2. Ацетон, х. ч.

3. Ацетон технический.

4. Калий-фосфатный буфер — 1 мМ раствор, рН 7,5.

5. Сухой лед.

6. Сульфат аммония, порошок.

7. Сульфат аммония, насыщенный раствор.

8. Сульфат аммония, насыщение 0,5.

О -7^7

Работу, если это специально не оговаривается, проводят в холодной комнате.

Подготовка исходного материала. Измельченные свежие пекарские дрожжи сушат на воздухе, помещая их на натянутую металлическую сетку, покрытую фильтровальной бумагой. Периодически бумагу меняют, дрожжи измельчают руками. Высушенные дрожжи хранят на холоде в герметической упаковке.

Экстракция. Стакан с 200 г сухих дрожжей и 600 мл двузамещен-ного фосфата натрия помещают на два часа в водяной термостат при 37° С, перемешивая до получения однородной суспензии, затем оставляют на 3 ч при комнатной температуре, после чего центрифугируют 30 мин при 18 000 g.

Тепловая обработка. Центрифугат разливают в тонкие стеклянные пробирки, погружают в водяной термостат при 55° С на 16— 18 мин (в зависимости от диаметра и толщины стенок пробирок), охлаждают в водяной бане со льдом, центрифугируют 7 мин при 40 000 g и осадок отбрасывают. Центрифугат может ночь храниться в холодильнике.

Фракционирование ацетоном. Стакан с центрифугатом помещают в ацетоновую баню с температурой около —6° С, добавляют предварительно охлажденный до —5° С ацетон из расчета 50 мл на каждые 100 мл дрожжевого экстракта, поддерживая температуру смеси в стакане не выше—2° С. Центрифугируют при —2° С 5 мин при 15 000 g и к центрифуг ату, как и в первый раз, добавляют ацетон в количестве 55 мл на каждые 100 мл дрожжевого экстракта. Центрифугируют 5 мин при —2° С и 40 000 g; осадок суспендируют в 40 мл холодной воды и диализуют в течение 3 ч против одного литра фосфатного буфера, перемешивая и 3—4 раза меняя буфер.

Кристаллизация. Ферментный раствор центрифугируют 5 мин при 40 000 g, осадок отбрасывают; к центрифугату медлен

страница 141
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(22.02.2017)