химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

с же переносят в сосуд со льдом. Осадок, выпавший после тепловой обработки, удаляют центрифугированием (10 000 gf 20 мин). К центрифугату медленно добавляют насыщенный раствор сульфата аммония до помутнения. Для кристаллизации раствор оставляют на ночь на холоде.

Перекристаллизация. Суспензию центрифугируют (20 мин при 12 000 g). Кристаллический осадок растворяют в 1 мМ ЭДТА, содержащем 0,2 мМ ДТТ. Нерастворившийся осадок отбрасывают, к раствору добавляют сульфат аммония до насыщения 0,55. Это вызывает -кристаллизацию фермента. Через несколько дней кристаллы отделяют центрифугированием, взбалтывают в небольшом объеме полунасыщенного раствора сульфата аммония и хранят в виде суспензии на холоде.

Метод II Реактивы:

1 Калий-фосфатный буфер — 30 мМ раствор, рН 7,2, содержащий 5 мМ ЭДТА.

2. Сульфат аммония, перекристаллизованный в присутствии ЭДТА (1,5 г/л).

3. ЭДТА — 0,2 мМ раствор, доведенный имидазолом до рН 7,2.

4. Имидазол — 10 мМ раствор, приготовленный на 0,2 мМ ЭДТА и доведенный соляной кислотой до рН 7,2 (буфер А).

5. Трис — 50 мМ раствор, приготовленный на 0,2 мМ ЭДТА и доведенный соляной кислотой до рН 8,0 (буфер Б).

6. Трис — 50 мМ раствор, приготовленный на 0,2 мМ НАДН и доведенный соляной кислотой до рН 8,0 (буфер В).

7. Трис — 10 мМ раствор, приготовленный на 0,2 мМ растворе НАДН и 10 мМ NaCl и доведенный до рН 8,0 (буфер Г).

8. Трис — 10 мМ раствор, приготовленный на 0,2 мМ растворе НАДН и 0,1 М NaCl и доведенный до рН 8,0 (буфер Д).

9. Трис — 10 мМ раствор, приготовленный на 0,2 мМ растворе НАДН и 0,3 М NaCl и доведенный соляной кислотой до рН 8,0 (буфер Е).

В реактивы 3—9 непосредственно перед началом работы добавляют дитиотреитол до конечной концентрации 0,2 мМ.

10. НС1 — 0,5 н. раствор.

11. NaOH — 0,5 н. раствор.

12. Na2HP04 — 1 н. раствор.

13. Сефадекс G-50.

14. КМ-целлюлоза.

Все растворы готовят на бидистиллированной воде. Всю работу проводят при 2—4° С.

Экстракция. Мышечную массу (приготовление см. на с. 221) заливают холодным раствором экстракции: 30 мМ фосфат калия, 5 мМ ЭДТА, 0,5 мМ дитиотреитол, рН 7,2 (соотношение веса мышц к объему раствора экстракции 1:3). Мышцы гомогенизируют в течение 2—2,5 мин. Гомогенат перемешивают с помощью механической мешалки в течение 10—15 мин и центрифугируют (10 000 g, 30 мин). Полученный гомогенат пропускают через 6 слоев марли для удаления частиц жира. Измеряют объем экстракта.

Фракционирование сульфатом аммония. К экстракту медленно при перемешивании механической мешалкой добавляют сухой сульфат аммония (27,7 г на 100 мл). После добавления последней порции соли замутившийся экстракт перемешивают еще в течение 30 мин, а затем центрифугируют (20 000 g, 1 ч). Осадок отбрасывают, а супернатант пропускают через 6 слоев марли и определяют его объем. К полученному раствору вновь добавляют мелкоизмельченный сульфат аммония (10 г на 100 мл); после добавления последней порции соли раствор продолжают перемешивать еще в течение 30 мин, а затем центрифугируют (20 000 g, 1 ч). Супернатант отбрасывают. Осадок, содержащий лактатдегидрогеназу, можно оставить на ночь.

Обессоливание. Все дальнейшие процедуры желательно провести в течение одного дня. Осадок растворяют в минимальном объеме (около 3 мл) буфера следующего состава: 0,2 мМ ЭДТА, 0,2 мМ дитиотреитол (доведено имидазолом до рН 7,2) и наносят на колонку

(2x8 см) с сефадексом G-50, уравновешенную тем же буфером. Собирают фракции, содержащие лактатдегидрогеназу, и проверяют полноту удаления ионов сульфата (проба с ВаС12). Пробы, дающие даже минимальное помутнение, отбрасывают. Фракции, свободные от ионов сульфата, объединяют и определяют объем полученного раствора и концентрацию белка.

Хроматография на КМ-целлюлозе. Аффинная элюция. Измеряют рН раствора и доводят его соляной кислотой до 7,2. Раствор белка наносят на колонку с КМ-целлюлозой (13X5,5 см), уравновешенную буфером А, рН 7,2. После того как белок адсорбировался на колонке, ее промывают 75—100 мл буфера А (скорость тока —•200 мл/ч). На этой стадии может потребоваться использование перистальтического насоса. Затем колонку промывают буфером Б, рН 8,0. При этом элюируются различные примесные белки, а лактатдегидрогеназа остается связанной с носителем. После того как через колонку пройдет 5—6 объемов буфера Б, оптическая плотность элюата при 280 нм начинает уменьшаться. Необходимо продолжать промывание буфером Б до тех пор, пока снижение Л28о не прекратится (Л28о может достигнуть значения 0,1—0,2 или меньше). Затем на колонку подают буфер В. После прохождения через колонку 1—2 объемов этого буфера определяют активность лактатдегидрогеназы в собираемых фракциях. В случае ее отсутствия на колонку подают буфер Г. Определяют активность лактатдегидрогеназы во фракциях элюата. Если ее нет либо она незначительна, на колонку подают буфер Д. Собирают фракции, определяют в них активность фермента и содержание белка (по поглощению при 280 нм за вычетом фона, который дает НАДН). Фракции, содержащие наибольшую активность, объе

страница 140
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
прокатчики музыкального оборудования
Рекомендуем фирму Ренесанс - размеры винтовой лестницы в частном доме - оперативно, надежно и доступно!
стул zeta
временные склады для вещей

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(11.12.2016)