химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

слении молочной кислоты в пировиноградную ферментом лактатдегидрогеназой (КФ 1 1.1.27) при одновременном восстановлении никотинамидадениндинуклеотида (НАД+) в НАДН (с. 7).

8 Пробирки должны быть безукоризненно чистыми, обезжиренными и сухими (мыть горячей хромовой смесью, много раз промывать водопроводной и дистиллированной водой, сушить в сушильном шкафу и хранить в отдельной коробке).

Равновесие реакции сдвинуто в сторону образования молочной кислоты. Однако, если образующуюся пировиноградную кислоту связывать гидразином или семикарбазидом в виде гидразонов или семикарбазонов (с. 32) и реакцию проводить в щелочном буфере, молочную кислоту можно полностью перевести в пировиноградную. О количестве молочной кислоты судят по количеству образовавшегося НАДН, измеряя оптическую плотность при 340 нм (с. 7).

Реактивы:

1. Глицин-гидразиновый буфер, рН 9,0 (глицин — 0,1 М раствор* содержащий 0,1 М гидразин) 9.

2. НАД+ — 3-10-2 М раствор, рН 6,0.

3. Калий-фосфатный буфер — 0,1 М раствор, рН 7,4.

4. Лактатдегидрогеназа — 2 мг/мл (коммерческий препарат) или экстракт мышц в разведении 1 ".25 (как источник фермента). Растворы НАД и фермента необходимо держать на льду.

5. НС104 — 0,5 н. раствор.

6. NaOH — 2 н. раствор.

7. НС1 — 2 н. раствор.

8. КОН — 5 н. раствор.

9. Раствор молочнокислого лития или молочнокислого кальция (его концентрацию рассчитывают по формуле на с. 7).

Приготовление глицин-гидразинового буфера. Растворяют навески глицина и гидразина в небольшом количестве дистиллированной воды, доводят рН смеси 2 н. раствором NaOH до 9,0 (рН измеряют на потенциометре стеклянном электродом) и доливают дистиллированной водой до 100 мл.

Получение экстракта мышц. Мышцы задних конечностей только что декапитированной 10 крысы используют для получения экстракта, не содержащего митохондрий, как указано на с. 50. Экстракт можно долго хранить в замороженном виде: его разливают по 1 мл в пробирки и замораживают. Для определения молочной кислоты используют экстракт в разведении 1:25 (разводят 0,1 М раствором калий-фосфатного буфера, рН 7,4),

Заполнение проб для определения молочной кислоты

Объем, мл

Состав пробы

контрольная

опытная

1. Глицин-гидразиновый буфер . .

2. Раствор НАД

3. Раствор фермента или экстракт

4. Н20"

5. Исследуемый раствор

2,6 2,6

0,2 0,2

0,1 0,1

0,1

0,1

9 Вместо глицин-гидразинового буфера можно использовать глицин-семикарба-зидный буфер, рН 9,0 (глицин 0,1 М раствор, содержащий 0,1 М семикарбазид).

10 В дальнейшем, если не оговаривается специально, крысу непосредственно перед

опытом эвтаназируют мгновенной декапитацией.

9Q

Содержимое пробирок тщательно перемешивают и ставят в термостат при 25° С на 60 мин. После инкубации пробы охлаждают,, устанавливают «ноль» спектрофотометра по контролю и измеряют оптическую плотность пробы. Количество молочной кислоты в пробе рассчитывают учитывая все разведения.

При налаживании энзиматического метода определения молочной кислоты используют раствор молочнокислого лития или кальция. Количество соли молочной кислоты, которое необходимо поместить в кювету спектрофотометра, рассчитывают по формуле, приведенной на с. 7.

При определении содержания молочной кислоты в биологическом материале ткань только что убитого животного помещают в ступку, замораживают жидким азотом и растирают, постоянно подливая жидкий азот (ткань не должна размораживаться). Берут навеску растертой ткани и, заливают 5-кратным объемом холодного 0,5 М раствора НСЮ4, экстрагируют на холоде 30 мин. Белки удаляют центрифугированием.

Центрифугат нейтрализуют рассчитанным количеством 5 н. раствора КОН и оставляют на льду или в холодильнике не менее чем на 1 ч (можно оставить на ночь). Осадок перхлората калия КС104 удаляют центрифугированием при 2°—4° С. В полученном растворе определяют молочную кислоту, как указано выше.

7. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПИРОВИНОГРАДНОИ КИСЛОТЫ

МАНОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПИРУВАТДЕКАРБОКСИЛАЗЫ

Пировиноградная кислота под влиянием пируватдекарбоксилазы (КФ 4.1.1.1) подвергается декарбоксилированию с образованием эквимолекулярных количеств углекислого газа и ацетальдегида:

СН3СОСООН *ШВВЕ&>»™™*^ СН3СНО + со2.

Для количественного определения пировиноградной кислоты реакцию ведут в кислой среде. Выделяющийся углекислый газ определяют манометрически в аппарате Варбурга по увеличению парциального давления (с. 10). В качестве источника пируватдекарбоксилазы используют экстракт пивных дрожжей.

Реактивы:

1. Ацетатный буфер — 3 М раствор, рН 5,0. 2 КН2Р04 — 0,5 М раствор.

3. Экстракт пивных дрожжей (готовят из заранее высушенных дрожжей).

Приготовление сухих пивных дрожжей. Хорошо отпрессованные пивные дрожжи нижнего брожения тщательно размельчают, помещают тонким слоем на фильтровальную бумагу и сушат в токе теплого (не выше 40° С) воздуха, периодически перемешивая. Высушенные дрожжи хранят в плотно закрытых стеклянных банках в холодильнике.

11 При взятии навесок удобно пользоваться р

страница 14
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
Интернет-магазин КНС Нева предлагает ноутбуки нр - кредит онлайн не выходя из дома в Санкт-Петербурге!
похожие кровати на атриа торис
тикетлэнд руки вверх концерт
wizardfrost.ru

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(29.05.2017)