химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

рость элюции — 20 мл/ч. Фракции белка с ферментативной активностью объединяют и диализуют против 80%-ного раствора сульфата аммония, содержащего 10 мМ 2-меркаптоэтанол. Фермент хранится несколько месяцев при 0—4° С.

Если в препарате пируваткиназы имеется примесь аденилаткиназы и лактатдегидрогеназы, то ее можно удалить с помощью гельфильтра-ции на колонке (50x2,5 см) с сефадексом G=200. На колонку наносят 10—20 мг белка и элюируют со скоростью 10—15 мл/ч 50 мМ К-фосфатным буфером, содержащим 10 мМ 2-меркаптоэтанол, рН 7,0.

ЛИТЕРАТУРА

1. Cardenas J., Dyson R., Strandholm J. Bovine Pyruvate Kinases. Purification and characterization of the skeletal muscle isozyme//J. Biol. Chem. 1973. Vol. 248, N 20. P. 6931.

'Л, п а г к in ь ц., DiacK J., nmeuuerg m. ruiuiwuun anu ciiaraciei l^auun ui

human muscle pyruvate kinase//Can. J. Biochem. 1977. Vol. 55. P. 301.

3. Kayne F. J. Pyruvate Kinase//The Enzymes. N. Y., 1973. Vol. 8. P. 353.

4. К wan C.-J., Davis R. pH-Dependent amino acid induced conformational changes of rabbit muscle pyruvate kinase//Can. J. Biochem. 1980. Vol. 58. P. 188.

15. ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗА

(L-лактат: НАД+-оксидоредуктаза, КФ 1.1.1.27)

Лактатдегидрогеназа катализирует реакцию восстановления пировиноградной кислоты в молочную:

Н

СН3—С—СОСГ + НАДН + Н+ ^1— СН3—G-COO~

II I

О ОН + НАДГ

Лактатдегидрогеназа — тетрамер (молекулярная масса 135 000— 140 000 Да), построенный из мономеров двух типов. Известны пять изоферментов лактатдегидрогеназы: ЛДГЬ ЛДГ2, ЛДГ3, ЛДГ4 и ЛДГ5 (с. 336), отличающихся по физико-химическим и кинетическим свойствам. Лактатдегидрогеназа содержит реакционноспособные SH-группы, модификация которых приводит к потере активности. Фермент ингиби-руется малонатом, оксалатом, оксаматом, избытком пирувата, избытком НАД+. Константы Михаэлиса лактатдегидрогеназы мышц: для пирувата — 0,16 мМ, для НАДН — 0,025 мМ.

Определение активности лактатдегидрогеназы

Активность лактатдегидрогеназы измеряют спектрофотометри-чески при 340 нм по нарастанию (в реакции окисления лактата — А) или убыли (в реакции восстановления пирувата — Б) пирувата.

Реактивы:

1. Глициновый буфер — 0,1 М раствор, рН 9,0, содержащий 50 мМ гидразин.

2. Калий-фосфатный буфер — 0,1 М раствор, рН 7,0.

3. Лактат — 0,2 М раствор.

4. Пируват — 0,16 М раствор.

5. НАД+ — 7,5 мМ раствор.

6. НАДН — 12 мМ раствор.

Все растворы готовят на бидистиллированной воде.

А. В спектрофотометрическую кювету помещают реакционную смесь, содержащую в объеме 3 мл 0,1 М глициновый буфер, рН 9,0, содержащий 50 мМ гидразин (2,5 мл), а также лактат (конечная концентрация — 6,7 мМ) и НАД+ (конечная концентрация — 0,25 мМ). Реакцию начинают добавлением 20—30 мкл раствора лактатдегидрогеназы. Измеряют нарастание поглощения при 340 нм.

Б. В спектрофотометрическую кювету помещают реакционную смесь, содержащую в объеме 3 мл 0,1 М фосфатный буфер, рН 7,0 (2,5 мл), а также пируват (конечная концентрация — 1,6 мМ) и НАДН (конечная концентрация — 0,2 мМ). Реакцию начинают добавлением —сш мкл раствора лактатдет/идрогеназы. Измеряют убыль поглощения при 340 нм.

Определение белка проводят спектрофотометрически, учитывая,

что при 280 нм Ai?„ =14,5.

Выделение и очистка фермента из скелетных мышц кролика

Метод I Реактивы:

1. КОН — 0,03 н. раствор, приготовленный на 1 мМ ЭДТА.

2. Сульфат аммония, перекристаллизованный в присутствии ЭДТА (1,5 г/л).

3. Сульфат аммония — насыщенный раствор, доведенный аммиаком до рН 7,5.

4. Дитиотреитол (ДТТ).

Все растворы готовят на бидистиллированной воде. Всю работу проводят при 2—4° С.

Экстракция. К 150—200 г охлажденной мышечной массы (получение см. на с. 221) добавляют равный (по отношению к весу ткани) объем 0,03 н. раствора КОН, содержащего 1 мМ ЭДТА и 0,2 мМ ДТТ, экстрагируют в течение 10 мин, после чего центрифугируют (20 мин, 10 000 g). Осадок повторно экстрагируют половинным объемом щелочи в течение 5 мин и вновь центрифугируют; рН экстракта колеблется от 6,6 до 7,3.

Фракционирование сульфатом аммония. К экстракту добавляют небольшими порциями при помешивании раствор сульфата аммония до насыщения 0,52 (104 мл на 100 мл экстракта). Через 30—40 мин после добавления последней порции раствора соли смесь центрифугируют (можно слить на воронку и оставить на ночь для фильтрования). Осадок отбрасывают, к раствору добавляют сухой, хорошо измельченный сульфат аммония до насыщения 0,72 (13 г на 100 мл). Через 30—40 мин после добавления последней порции соли смесь центрифугируют (3000 g, 30 мин). Осадок растворяют в небольшом количестве бидистиллированной воды, чтобы концентрация белка была равна 20—25 мг/мл. К этому раствору добавляют насыщенный раствор сульфата аммония до достижения насыщения 0,55 (122 мл на 100 мл). После стояния в течение 30 мин центрифугируют (3000 g, 30 мин). Осадок растворяют в небольшом объеме воды.

Тепловая обработка и кристаллизация. Раствор белка ставят на 3 мин на водяную баню, нагретую до 58° С, после чего тотча

страница 139
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
утеплитель rockwool цена за м3
http://www.prokatmedia.ru/notebook.html
руки вверх купить билеты на концерт москва
театр российской армии афиша

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(17.08.2017)