химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

вносят следующие компоненты реакции (даны конечные концентрации): 50 мМ трис-HCl буфер, рН 7,4; 100 мМ КС1, 10 мМ MgCl2; 2 мМ АДФ; 0,8 мМ фосфоенолпируват; 0,16 мМ НАДН; 5 ед/мл лактатдегидроге-назы. Смесь преинкубируют 2—3 мин, после чего реакцию начинают добавлением пируваткиназы. Регистрируют уменьшение оптической плотности при 340 нм.

Определение белка проводят микробиуретовым методом (с. 81). Концентрацию очищенной пируваткиназы можно измерять спектрофотометрически при 280 нм, используя коэффициент ЛГш=5,5.

Выделение и очистка пируваткиназы из скелетных мышц кролика

Метод I Реактивы:

1. ЭДТА — 2 мМ раствор, рН 7,0 (раствор для экстракции).

2. (NH4)2S04 — сухой, перекристаллизованный из 5 мМ раствора ЭДТА, рН 8,3.

3. Ацетатный буфер — 0,5 М раствор, рН 4,7 (для приготовления буфера используют уксусную кислоту и КОН).

4. (NH4)2S04 — 3,2 М раствор.

5. NH4OH — 1 н. раствор.

Работу проводят в холодной комнате.

Экстракция. Измельченную мышечную массу (с, 221) взвешивают и гомогенизируют 1 мин в двойном объеме раствора ЭДТА. Перемешивание гомогената продолжают в течение 30 мин. Центрифугируют 20 мин при 13 000 g. Ткань повторно гомогенизируют в одном объеме того же раствора. После центрифугирования супернатанты объединяют и фильтруют через стеклянную вату.

Фракционирование сульфатом аммония. К объединенному супернатанту медленно, при постоянном перемешивании, добавляют сухой сульфат аммония (260 г на 1 л) до концентрации 1,75 М. Перемешивание продолжают в течение 30 мин. Затем суспензию центрифугируют 20 мин при 10 000 g. Осадок отбрасывают. В супернатанте увеличивают концентрацию сульфата аммония до 2,4 М (105 г/л). Перемешивание продолжают еще 30 мин, после чего центрифугируют. Осадок -отбрасывают. Концентрацию сульфата аммония проверяют, используя реактив Несслера (с. 87). В супернатанте доводят концентрацию сульфата аммония до 2,6 М (39 г/л). Перемешивают в течение часа, центрифугируют 20 мин при 15 000 g. Супернатант отбрасывают. Осадок растворяют в минимальном объеме 0,2 М ацетатного буфера, рН 4,7.

Кристаллизация. Раствор белка доводят 1 н. раствором аммиака до рН 5,4 и медленно насыщают сухим сульфатом аммония (21 г/л). После этого проверяют рН и с помощью ацетатного буфера (рН 4,7) доводят раствор белка до рН 5,15. Суспензию оставляют при 0—4° С для кристаллизации. Кристаллы собирают центрифугированием (20 мин 15 000 g) и суспендируют в 3,2 М растворе сульфата аммония.

М е т о д II

Реактивы:

1. ЭДТА — 1 мМ раствор, рН 7,0 (раствор для экстракции).

2. Имидазол — 1 М раствор, рН 7,0.

3. СНзСООН — 1 М раствор.

4. NH4OH — 1 М раствор.

5. (NH4)2S04 — сухой, перекристаллизованный из раствора ЭДТА — 5 мМ, рН 8,3, мелкоизмельченный.

6. Меркаптоэтанол.

7. КМ-целлюлоза. f

8. К-фосфатный буфер — 30 мМ раствор, рН 6,0.

9. КС1 — 0,3 М раствор, приготовленный на К-фосфатном буфере, рН 6,0.

10. (NH4)2S04 — 80%-ный раствор.

Экстракция. Мышечную массу (с. 221) взвешивают и гомогенизируют 30 с в двойном объеме 1 мМ раствора ЭДТА, рН 7,0. Перемешивание гомогената продолжают в течение часа с помощью механической мешалки. После этого центрифугируют 20 мин при 8000 g. Супернатант фильтруют через стеклянную вату. Осадок отбрасывают.

Тепловая обработка. К отфильтрованному супернатанту добавляют 1 М имидазол до конечной концентрации 20 мМ. Проверяют рН белкового раствора и, если нужно, доводят его значение до 7,0 СНзСООН или аммиаком. На водяной бане (80°С) нагревают белковый раствор до 60° С, инкубируют 5 мин при постоянном перемешивании. После этого ргствор быстро помещают в лед и охлаждают до 10° С. Выпавший осадок отделяют центрифугированием (20 мин, 10 000 g).

Фракционирование сульфатом аммония. К полученному супернатанту медленно, при постоянном перемешивании, добавляют хорошо измельченный сульфат аммония до 54%-ного насыщения (320 г/л). При насыщении сульфатом аммония белковый раствор тщательно охлаждают в сосуде с тающим льдом. Перемешивание продолжают в течение 30 мин, ^атем центрифугируют 20 мин при 10 000 g. Осадок отбрасывают. К супернатанту добавляют сульфат аммония до 67,5% ~ ного насыщения (83,5 г/л). Перемешивание продолжают 30 мин и вновь центрифугируют. Супернатант отбрасывают, осадок суспендируют в 80%-ном растворе сульфата аммония, содержащем 10 мМ 2-меркаптоэтанол. Концентрация белка в суспензии составляет '20— 40 мг/мл. На этой стадии фермент может храниться при 4° С несколько дней без потери активности.

Ионообменная хроматография. Колонку (40x2,5 см), заполненную КМ-целлюлозой (с. 109), уравновешивают 30 мМ К-фосфатным буфером, рН 6,0, содержащим 10 мМ 2-меркаптоэтанол. Перед нанесением на колонку раствор белка диализуют против уравновешивающего буфера до полного удаления сульфата аммония. На колонку можно нанести до 500 мг белка. После нанесения белка колонку промывают уравновешивающим буфером (примерно 75 мл). Для элюции фермента используют линейный градиент концентрации КС1 от 0 до 0,3 М в том же буфере. Общий объем растворов — 1 л. Ско

страница 138
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
wizardfrost.ru
кеды футзальные
richardson sheffield цена
кастрюли из нержавейки с толстым дном купить

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(26.04.2017)