химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

ния (фракция 2). В супернатанте медленным (в течение нескольких дней) добавлением сульфата аммония молярность повышают до 2,3. Осадок отделяют центрифугированием и также суспендируют в 1,9 М растворе сульфата аммония (фракция 3).

9fift

Фракции 1 и 3 соединяют, суспендируют в 1,75 М сульфате аммония и нагревают в течение 4 ч до 25—30° С. Это приводит к растворению кристаллов альдолазы, загрязняющих препарат. Центрифугируют, осадок промывают 1,85 М раствором сульфата аммония и соединяют с фракцией 2. Дальнейшая очистка заключается в промывании осадка 1,85 М раствором сульфата аммония, при этом концентрация белка в растворе не должна быть ниже 20 мг/мл Для перекристаллизации препарат растворяют в холодном растворе ЭДТА (концентрация белка 20—30 мг/мл), денатурировавший, белок отделяют центрифугированием и к супернатанту добавляют сухой сульфат аммония до слабого помутнения. Кристаллизация завершается при достижении концентрации сульфата аммония, равной 1,85 М.

В ходе выделения фермента необходимо постоянно контролировать молярность сульфата аммония. Это осуществляют путем колориметрического определения концентрации иона NH4+ с реактивом Несслера (с. 87).

ЛИТЕРАТУРА

1. Baranowski Т. a-Glycerophosphate dehydrogenase//The Enzymes. N. Y., 1963. Vol. 7. P. 85.

~2. В e i s e n h e г z G., В о 11 z e H. J., В u с h e r T. et al. Diphosphofructose-Aldolase, Phosphoglyceraldehyde Dehydrogenase, Milchsaure Dehydrogenase, Glycerophosphate Dehydrogenase und Pyruvat Kinase aus Kaninchenmuskulatur in einem Arbeitsgang// //Z. Naturforschg, 1953. Bd 8 b. S. 555.3. Kim S. J., Anderson В. M. Coenzyme binding to /.-glycerophosphate dehydrogenase//,!. Biol. Chem. 1969. Vol. 244. P. 1547.

4. F о n d у Т. P., Ross C. R., S о 11 о h u b S. J, Structural studies on rabbit muscle glycerol-3-phosphate dehydrogenase and a comparison of chemical and physical determinations of its molecular weight/7J. Biol. Chem. 1969. Vol. 244. P. 1631.5 Apitz-Castro R., Suarez Z. Structural studies on the active centre of «-glycerophosphate dehydrogenase//Biochem. Biophys. acta. 1970. Vol. 198. P. 176.

14. ПИРУВАТКИНАЗА

(АТФ: пируват-фосфотрансфераза, КФ 2.7.1.40)

Пируваткиназа катализирует необратимую реакцию превращения *фосфоенолпнрувата в пируват, сопровождающуюся образованием АТФ:

сн2 сн3

j_0-P0f "ируваткиназа ^ !

I Mg2t |

соо~ ^—\ сооАТФ

Реакция протекает с выделением энергии (AG0'= —7,5 ккал/моль). В тканях млекопитающих известны три изозима пируваткиназы, каждый состоит из четырех идентичных субъединиц. Изозимы имеют молекулярную массу от 200 000 до 250 000 Да; молекулярная масса ?субъединицы — от 50 000 до 61000 Да. Фермент характеризуется высокой специфичностью по отношению к фосфоенолпирувату, менее специфичен к нуклеотидному субстрату. Пируваткиназа относится к труппе аллостерических ферментов. Изозимы пируваткиназы отличаются своими регуляторными свойствами. Ферментативная реакция, катализируемая высокоочищенной пируваткиназой из * скелетных мышц, описывается кинетикой Михаэлиса—Ментен. Аллостерические свойства фермента выявляются в присутствии аминокислот-ингибиторов. Так, кривая зависимости скорости реакции от концентрации субстрата в присутствии L-фенилаланина (5—10 мМ) имеет S-образную форму. Аллостерическое поведение фермента наблюдается при рН выше 7,0 (7,5—7,6), а также в присутствии низкой концентрации субстрата — фосфоенолпирувата (0,2—0,3 мМ). Степень ингибирования пируваткиназы ?-фенилаланином уменьшается при добавлении в реакционную смесь L-аланина. Действие аллостерических ингибиторов приводит к уменьшению сродства фермента к субстрату (фосфоенолпнру-вату). Пируваткиназа скелетных мышц ингибируется АТФ, ацетил-КоАг высокомолекулярными жирными кислотами. Активаторами фермента являются ионы К+, Mg2+, ионы Na+ оказывают ингибирующее влияние.

Величины кажущихся констант Михаэлиса колеблются в зависимости от используемого буфера, рН, температуры и других условий. В трис-HCl буфере, рН 7,4, Кт для АДФ — 0,25 мМ, для фосфоенолпирувата — 0,048 мМ.

Определение активности пируваткиназы

Активность пируваткиназы определяют по образованию пирувата, количество которого измеряют в системе, содержащей лактатдегидро-геназу и НАДН:

пируачткиназа

фосфоенолпируват —Mg_Afl(b—*? дируват -f Mg—АТФ

лактатдегидрогеназа НАДН4 Н+

т

лактат + НАД+

Реактивы:

1. Трис-HCl — 60 мМ раствор, рН 7,4.

2. КС1 — 3 М раствор.

3. MgCl2 — 0,3 М раствор.

4. АДФ — 60 мМ раствор.

5. Фосфоенолпируват — 24 мМ (трициклогексиламмониевая соль, или К-соль). Ag—Ва-соль фосфоенолпирувата переводят с помощью катионообменника типа Дауэкс-50 в К-соль (с. 43).

6. НАДН — 5 мМ раствор, рН 7,5.

7. Лактатдегидрогеназа.

8. Пируваткиназа. Раствор фермента разводят трис-HCl буфером непосредственно перед определением активности.

Растворы готовят на бидистиллированной воде. Растворы ферментов, НАДН и фосфоенолпирувата до внесения в реакционную смесь хранят на льду.

В спектрофотометрическую кювету (объем 3 мл)

страница 137
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
курс excel в южном бутово
установка катализаторов nissan
виллерой бош сантехника адреса в москве
мебель из стекла москва

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(05.12.2016)