химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

тдегидрогеназа угнетается SH-pea-гентами, а также ионами тяжелых металлов. Константы Михаэлиса для НАДН — 11,9 мкМ, глицерол-3-фосфата — 0,18 мМ, НАД+ — 0,012 мМ, фосфодиоксиацетона — 0,2 мМ. АМФ, АДФ, АДФ-рибоза являются коэнзим-конкурентными ингибиторами.

Определение активности глицерол-З-фосфатдегидрогеназы

Активность фермента определяют спектрофотометрически, измеряя убыль или нарастание НАДН в ходе реакции.

Реактивы:

1 Трис-HCl буфер — 0,1 М раствор, рН 7,8, содержащий 1 мМ ЭДТА и 1 мМ дитиотреитол.

2 Пирофосфатный буфер — 0,05 М раствор, рН 9,0, содержащий 1 мМ ЭДТА и 1 мМ дитиотреитол.

3 Гидразин — 0,6 М раствор.

4 Фосфодиоксиацетон — 18 мМ раствор (либо раствор смеси фосфотриоз) .

5 НАДН — 3,6 мМ раствор. 6. НАД+ — 3,6 мМ раствор.

Все растворы готовят на бидистиллированной воде.

А Реакция восстановления фосфодиоксиацетона

В спектрофотометрическую кювету помещают 0,1 М трис-HCl б^ фер, рН 7,8 (2,5 мл), фосфодиоксиацетон (конечная концентрация — 3 мМ) и НАДН (конечная концентрация — 0,12 мМ). Объем пробы доводят до 3 мл. Реакцию начинают добавлением 30—50 мкл раствора фермента. Измеряют уменьшение поглощения при 340 нм.

Б. Реакция окисления глицерол-3-фосфата

В спектрофотометрическую кювету помещают 0,05 М пирофосфатный буфер рН 9,0 (2,5 мл), гидразин (конечная концентрация — 20 мМ), глицерол-3-фосфат (конечная концентрация — 1,8 мМ), НАД+ (конечная концентрация — 1,2 мМ). Объем пробы доводят до 3 мл. Реакцию начинают добавлением 30—50 мкл раствора фермента. Измеряют нарастание поглощения при 340 нм. Определение белка проводят спектрофотометрически, учитывая, что при 280 нм Лп?м=7,4.

Исследование свойств фермента см. на с. 206.

Выделение фермента из скелетных мышц кролика

Реактивы:

1. Сульфат аммония, перекристаллизованный в присутствии ЭДТА (1,5 г/л).

2. Сульфат аммония — 1,4 М раствор, рН 5,7.

3. Сульфат аммония — 1,9 М раствор, рН 5,7.

Всю работу проводят в холодной'комнате. Растворы готовят на бидистиллированной воде, содержащей 5 мМ ЭДТА и 0,2 мМ дитиотреитол, рН 7,0.

Экстракция. Измельченную мышечную массу (с. 221) заливают двойным объемом воды с ЭДТА и экстрагируют в течение 30 мин. Экстракт отделяют центрифугированием (30 мин, 10 000 g). Экстракцию повторяют, залив мышечную массу половинным объемом воды.

Фракционирование сульфатом аммония. Измеряют объем соединенных экстрактов и начинают медленное добавление мелко измельченного сульфата аммония из расчета 275 г/л. При этом достигается концентрация 1,7 М. Для доведения рН до 5,8 используют разбавленные растворы аммиака и H2SO4. Через 2 ч осадок отделяют центрифугированием (10 мин, 10 000 g) и отбрасывают. К супернатанту вновь осторожно добавляют сульфат аммония до конечной концентрации 2,4 М (примерно 106 г/л). Аморфный осадок белков (фракцию 1,7 М — 2,4 М сульфата аммония) отделяют центрифугированием (15 мин, 10 000 g). Эта фракция содержит альдолазу, глицерол-3-фосфатдегид-рогеназу, пируваткиназу и лактатдегидрогеназу. Влажный осадок растворяют в полуторакратном по объему количестве воды с ЭДТА, что снижает концентрацию сульфата аммония приблизительно до 0,8 М. К раствору белка (65 мг/мл) медленно чобавляют сухой сульфат аммония до достижения концентрации последнего 1,4 М, рН доводят до 6,1.

При стоянии в течение ночи образуются кристаллы, которые отделяют центрифугированием (20 мин, 10 000 g). К супернатанту, содержащему сульфаг аммония в концентрации 1,4 М, медленно добавляют сульфат аммония до 1,75 М концентрации (доводят аммиаком до рН 6,1). Раствор стоит ночь на холоде, при этом начинается образование гексагональных кристаллов альдолазы (за которым можно следить, рассматривая каплю суспензии под микроскопом). Молярность сульфата аммония доводят до 1,82, контролируя рН (он должен быть равен 6,1). Кристаллизация альдолазы происходит в течение 24—36 ч.

Кристаллы отделяют центрифугированием, когда в супернатанте остается меньше 25% альдолазной активности (определение см. на с. 246). Чем полнее отделена альдолаза, тем лучше удается выделение глицерол-3-фосфатдегидрогеназы. Если глицерол-3-фосфатдегидрогена-за начинает кристаллизоваться на этом этапе (ее кристаллы имеют форму игл или пластинок), нужно быстро и на малой скорости от-центрифугировать осадок альдолазы так, чтобы более легкие кристаллы дегидрогеназы остались в супернатанте. Контроль за формой кристаллов осуществляют с помощью микроскопа.

Кристаллизация. К раствору, содержащему глицерол-3-фосфат-дегидрогеназу (фракция 1,82 М сульфата аммония, рН 6,1—6,2), добавляют медленно, в течение трех дней, сухой сульфат аммония до повышения его молярности до 2,0 М.

Появляются кристаллы с шелковистым блеском. Их отделяют центрифугированием и суспендируют в 1,9 М сульфате аммония (фракция 1). К супернатанту медленно (в течение 2—3 сут) добавляют сульфат аммония до достижения концентрации 2,1 М (рН 6,2). При этом кристаллизуется основная масса глицерол-3-фосфатдегидрогеназы. Осадок отделяют центрифугированием и суспендируют в 1,9 М сульфате аммо

страница 136
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
кабельщик обучение
решетка авр-к 600x150
наклейки на двери со стрелками
стандарт сп-02 скамья

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(21.01.2017)