химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

бразную массу оставляют на ночь. На следующий день перемешивание продолжают; всего оно должно осуществляться в течение 20—24 ч с момента добавления дрожжей. Затем к суспензии добавляют 800 мл 0,5 М молочной кислоты. Доводят рН до 7,0+0,5 холодной 5 М молочной кислотой, доведенной до рН 3,5 аммиаком. Смесь центрифугируют при 20 000g в течение 15 мин, осадок отбрасывают. Полученный экстракт содержит многие растворимые ферменты. Его можно использовать для выделения глюкозо-6-фосфатдегид-рогеназы, алкогольдегидрогеназы, гексокиназы, а также 3-фосфоглицераткиназы.

Фракционирование сульфатом аммония. К экстракту медленно добавляют сульфат аммония (100 г/л). Доводят рН до 4,3 холодным раствором 5 М лактата аммония, рН 3,5, как описано выше. Для этого требуется около 50 мл лактата аммония. Во время этой процедуры необходимо тщательное перемешивание. После стояния в течение 10 мин при рН 4,3 смесь центрифугируют (15 мин при 20 000 g), осадок отбрасывают. Снова добавляют сульфат аммония (250 г/л); процесс ведут медленно, в течение 15 мин при перемешивании. После 30-минутного стояния смесь центрифугируют, как описано выше. Супернатант отбрасывают. Осадок растворяют в 800 мл 40 мМ раствора триса, содержащего 1 мМ ЭДТА. Если необходимо, добавляют 1 М трис для доведения рН до 7,5+0,2. К полученному раствору добавляют при перемешивании в течение 15 мин 340 г сульфата аммония на 1 л. После 30-минутного стояния смесь центрифугируют, осадок отбрасывают. Снова добавляют сульфат аммония (150 г/л), образующийся осадок собирают центрифугированием, как указано выше. Этот осадок растворяют в небольшом объеме 1 мМ ЭДТА, рН 7,0.

Обессоливание. Раствор обессоливают перед нанесением на колонку с КМ-целлюлозой. Это можно осуществить либо диализом, либо гель-фильтрацией через большую колонку с сефадексом G-25. Диализ следует проводить против проточной воды в течение по крайней мере 3 ч, и затем в течение ночи против 5 л 1 мМ ЭДТА, рН 7,0. Утром буфер нужно сменить и продолжить диализ еще в течение нескольких часов.

Хроматография на КМ-целлюлозе. К раствору белка добавляют раствор протаминсульфата (1 г/50 мл воды), доведенный трисом до рН 7,0. Полученный осадок удаляют центрифугированием. Затем к супернатанту добавляют 0,01 объема 1 М раствора триса и понижают рН до 6,0 с помощью 1 М какодиловой кислоты. Разводят раствор до 800 мл добавлением 10 мМ триса, содержащего 1 мМ ЭДТА (рН 6,0, доведено какодиловой кислотой), и наносят его на колонку (4,5x30см) с КМ-целлюлозой, уравновешенную 10 мМ трисом, 1 мМ ЭДТА, доведенным до рН 6,0 какодиловой кислотой. После нанесения белка на колонку начинают элюцию линейным градиентом КС1. Для создания градиента используют два сосуда, один из которых содержит 1 л буфера, а другой — 1 л буфера, приготовленного на 0,2 М КО. Скорость тока — 120 мл/ч. Фракции, содержащие более 300 единиц активности фермента в 1 мл, объединяют.

Концентрирование и гель-фильтрация. К раствору медленно, при перемешивании, добавляют 600 г сульфата аммония на 1 л. После 30-минутного стояния осадок собирают центрифугированием (30 мин при 20 000g) и растворяют в небольшом объеме воды. Доводят раствор до объема 40—50 мл, нерастворившийся оссдок отделяют центрифугированием. Половину центрифугата наносят на колонку с сефадексом G-100 (ЗхПО см), уравновешенную 0,15 М NaCl, содержащим 1 мМ ЭДТА и 10 мМ имидазол, рН 7,0 Элюцию проводят в течение 8—10 ч со скоростью тока 30—40 мл/ч. Аналогичным образом обрабатывают вторую половину раствора.

Кристаллизация. Фракции, содержащие активность фермента, объединяют и добавляют к ним медленно, при перемешивании, 600 г/л сульфата аммония. После 30-минутного стояния осадок отделяют центрифугированием и растворяют в 20 мМ калий-фосфатном буфере, рН 6,5 до достижения концентрации белка 20—30 мг/мл. К раствору медленно добавляют насыщенный раствор сульфата аммония до помутнения. Кристаллизация проходит при комнатной температуре и заканчивается через несколько дней.

ЛИТЕРАТУРА

1. Banks R. D, Blake С. С. F., Evans P R et al Sequence, structure and activity of phosphoglycerate kinase a possible hinge-bending enzyme//Nature 1979. Vol. 279. P. 773.

2. Krietsch W. K., Bucher T. 3-Phosphoglycerate Kinase from rabbit skeletal muscle and yeast//Eur. J. Biochem. 1970. Vol 17 P. 568.

3. Fifis Т., Scopes R. K. Purification of 3-Phosphoglycerate Kmase from diverse sources by affinity elution chromatography//Biochem J 1978 Vol. 175. P. 311.

4. Scopes R. K. The steady-state kinetics of yeast Phosphoglycerate Kinase//Eur. J. Biochem. 1978. Vol. 85. P. 503.

13. ГЛИЦЕРОЛ-3-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗА

(L-глщерол-З-фосфат: НАД+-оксидоредуктаза, КФ 1.1.1.8)

Глицерол-З-фосфатдегидрогеназа катализирует реакцию восстановления фосфодиоксиацетона в глицерол-3-фосфат:

СН2—ОН

СН2ОН

с=о

+ НАДН + Н +- —*? Н—С—ОН

+ НАД+

СН2—О—РОз

СН2—О—РОз

Глицерол-З-фосфатдегидрогеназа — димер, состоящий из идипали-вых субъединиц. Молекулярная масса фермента из мышц кролика составляет 78 000 Да. Глицерол-З-фосфа

страница 135
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
акустические панели для мини кинозалов
брно отель
gw-gm560/3n1v цена
продам столик журнальный

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(18.12.2017)