химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

центрифугируют (30 мин при 10 000g).

Фракционирование сульфатом аммония. К прозрачному супернатанту медленно добавляют сульфат аммония (40 г на 100 мл). После добавления последней порции раствор перемешивают в течение часа и вновь центрифугируют (30 мин при 20 000 g). Осадок отбрасывают, а к супернатанту снова добавляют сульфат аммония (11,6 г на 100 мл). Спустя час после добавления последней порции центрифугируют (30 мин при 20 000^). Полученный осадок используют для дальнейшей очистки фермента.

Тепловая обработка. Осадок растворяют в минимальном объеме 0,1 М ацетата натрия, доведенного уксусной кислотой до рН 5,6. Полученный раствор подвергают нагреванию в течение 10 мин при 45° С. Тепловую обработку проводят непосредственно в центрифужном стакане, после чего пробу быстро охлаждают до 0°С. Денатурировавший белок удаляют центрифугированием (30 мин при 20 000 g).

Обессоливание. В прозрачном супернатанте доводят рН до 7,0 1 М раствором триса и наносят раствор белка на колонку с сефадексом

G-50 для обессоливания (размер колбнки 4X40 см). Предварительно колонку уравновешивают 0,2 М ЭДТА, доведенным 1 М раствором триса до рН 7,5—7,8. В обессоленных фракциях определяют активность 3-фосфоглицераткиназы. Выход соли с колонки регистрируют пробой с ацетатом бария. Необходимо следить, чтобы белковые фракции были тщательно обессолены, так как примесь сульфата в растворе не позволит «посадить» белок на ионообменник (с. 108).

Хроматография на КМ-целлюлозе и кристаллизация. 5 мл 1 М раствора триса доводят сухим MES до рН 6,5 (±0,1) и добавляют этот раствор в обессоленные белковые фракции с таким расчетом, чтобы конечная концентрация триса составила 10 мМ. Затем раствор белка наносят на колонку (3X4 см) с КМ-целлюлозой, уравновешенную 10 мМ трисом, доведенным сухим MES до рН 6,5 (±0,1). После нанесения белка на ионообменник колонку промывают 50—100 мл буфера (10 мМ трис-MES, рН 6,5), а затем начинают промывать колонку буфером: 10 мМ КОН, доведенный трицином до рН 7,9 (±0,1) и содержащий 3 М ацетат натрия. Скорость тока через колонку следует установить около 200 мл/ч; по мере связывания белка на колонке скорость тока может значительно упасть; в этом случае можно увеличить давление, подаваемое на колонку, с помощью перистальтического насоса.

При связывании фермента на колонке при рН адсорбции 6,5 в верхней части ионообменника образуется ярко-красное кольцо мышечных белков, а по мере заполнения колонки белком целлюлоза приобретает опаловую, бледную желтизну. Граница раздела между матовой и желтовато-опаловой зонами постепенно продвигается книзу. После подачи на колонку буфера рН 7,9 (КОН-трицин) красное кольцо мышечных белков начинает постепенно двигаться книзу, разделяясь при этом на несколько отдельных колец и прокрашивая целлюлозу в бледно-розовый цвет. Необходимо дождаться выхода этого материала с колонки (для этого через колонку должно пройти 6—10 объемов колонки буфера, рН 7,9). После того как поглощение при 280 нм в эдюате снизится до значения 0,1—0,2, на колонку подают буфер (10 мМ КОН-трицин, рН 7,9), содержащий вместо 3 мМ ацетата натрия 0,5 мМ 3-фосфоглицерат. Фермент выходит резким пиком (в максимуме —? несколько единиц оптической плотности) с фронтом субстрата и тянется небольшим «хвостом».

Фракции, содержащие 3-фосфоглицераткиназу, объединяют и добавляют сухой сульфат аммония, доводя раствор до помутнения. Фермент кристаллизуется в течение нескольких дней. Кристаллы отделяют центрифугированием и растворяют их в небольшом объеме буфера: 30 мМ имидазол, содержащий 5 мМ ЭДТА и 2 мМ дитиотреитол, рН 7,0. Медленным добавлением сухого сульфата аммония доводят раствор до помутнения. Кристаллы хранят в виде суспензии в насыщенном растворе сульфата аммония, содержащем 30 мМ имидазол, 5 мМ ЭДТА и 2 мМ дитиотреитол, рН 7,0.

Выделение фермента из пекарских дрожжей

Реактивы:

1. Сульфат аммония, перекристаллизованный в присутствии ЭДТА (1,5 г/л).

2. Сульфат аммония, насыщенный раствор.

3. NH4OH — 0,5 М раствор, содержащий 1 г ЭДТА/л.

4. Калий-фосфатный буфер — 20 мМ раствор, рН 6,5.

5. ЭДТА — 1 мМ раствор, рН 7,0.

6. Молочная кислота — 5 М раствор, доведенный аммиаком до рН 3,5.

7. Молочная кислота — 0,5 М раствор.

8. Трис — 40 мМ раствор, содержащий 1 мМ ЭДТА.

9. Трис — 1 М раствор.

10. Протаминсульфат — 2%-ный раствор, доведенный трисом до рН 7,0.

11. Какодиловая кислота — 1 М раствор.

12. Трис — 10 мМ раствор, содержащий 1 мМ ЭДТА, доведенный до рН 6,0 какодиловой кислотой.

13. NaCl — 0,15 М раствор, содержащий 1 мМ ЭДТА и 10 мМ имидазол, рН 7,0.

14. КМ-целлюлоза.

15. Сефадекс G-25.

16. Сефадекс G-100.

Всю работу проводят при комнатной температуре.

Экстракция. Цитолиз дрожжей осуществляют путем инкубации в растворе аммиака. К литру 0,5 М NH4OH, содержащего 1 г ЭДТА, при интенсивном перемешивании медленно добавляют 450 г высушенных дрожжей. Эта процедура занимает 30 мин. Образующиеся сгустки размельчают и перемешивание продолжают в течение нескольких часов; студнео

страница 134
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
симферополь обучение газокотлов
короб витринный открывающаяся для афиши
пламегаситель alfa romeo
реакционный артрит у детей

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(16.12.2017)