химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

чески при 280 нм, учитывая, что Л^^=5,7 (фермент из мышц кролика) и 5,3 (фермент из пекарских дрожжей).

Выделение и очистка 3-фосфоглицераткиназы из скелетных мышц кролика

Метод I Реактивы:

1. Сульфат аммония, перекристаллизованный в присутствии ЭДТА (1,5 г/л).

2. Сульфат аммония — 0,1 М раствор, содержащий 1 мМ ЭДТА и 1 мМ дитиотреитол, рН 6,0.

3 Натрий-фосфатный буфер — 0,1 М раствор, рН 7,6, содержащий 10 мМ ЭДТА и 1 мМ дитиотреитол.

4. Триэтаноламиновый буфер — 0,05 М. раствор, рН 7,6, содержащий 2,0 М сульфат аммония и 1 мМ дитиотреитол.

5. Триэтаноламиновый буфер — 10 мМ раствор, рН 8,0, содержащий 1 мМ ЭДТА и 1 мМ дитиотреитол.

6. ЭДТА — 10 мМ раствор, содержащий 1 мМ дитиотреитол, рН 7,6.

7. Сефадекс G-75.

8 ДЭАЭ-сефадекс Л-25.

Все растворы готовят на бидистиллированной воде; работу проводят при 2—4° С.

Экстракция. Измельченную мышечную массу (500 г) (с 221) суспендируют в пяти объемах 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,6), содержащего 10 мМ ЭДТА и 1 мМ дитиотреитол. После 60-минутного перемешивания механической мешалкой суспензию центрифугируют (20 мин при 10 000^).

Фракционирование сульфатом аммония. К экстракту медленно, при помешивании, добавляют мелкоизмельченный сульфат аммония до достижения концентрации 2,6 М и оставляют на ночь на холоде. Осадок отделяют центрифугированием (40 мин при 15 000 g) и к супернатанту добавляют сульфат аммония до концентрации 3,2 М. После стояния в течение 1 ч осадок собирают центрифугированием (40 мин при 15 000^) и используют для дальнейшей работы.

Тепловая обработка. Около 1/4 всего количества осадка растворяют в 0,05 М триэтаноламиновом буфере, рН 7,6, содержащем 2,0 М сульфат аммония и 1 мМ дитиотреитол, до достижения концентрации белка 40 мг/мл и инкубируют в водяной бане при 50° С в течение 5 мин Затем быстро охлаждают в ледяной бане и денатурировавшие белки удаляют центрифугированием при 15 000 ^ в течение 40 мин. Белок из раствора осаждают добавлением сульфата аммония до 3,2 М концентрации, центрифугируют (40 мин при 15 000 g) и осадок растворяют в 10 мМ ЭДТА, содержащем 1 мМ дитиотреитол (рН 7,6). Проводят диализ против того же раствора. После диализа концентрация белка должна составлять 50—60 мг/мл. Этот раствор используют для дальнейшей очистки фермента.

Гель-фильтрация. Готовят колонку (20x40 см), заполненную сефадексом G-75 и уравновешенную 0,1 М сульфатом аммония, содержащим 1 мМ. ЭДТА и 1 мМ дитиотреитол, рН 6,0. На колонку наносят около 2 мл раствора белка и пропускают раствор, используемый для уравновешивания колонки. Анализируют фракции элюата, определяя в них содержание белка и активность фермента. Собирают и объединяют фракции, содержащие наибольшее количество активного белка. Гель-фильтрацию можно повторить на той же колонке с новыми порциями раствора белка. Объединенные элюаты концентрируют путем осаждения белка сульфатом аммония (конечная концентрация —? 3,2 М). Осадок растворяют в небольшом объеме 10 мМ триэтанолами-нового буфера, рН 8,0, содержащего 1 мМ ЭДТА и 1 мМ дитиотреитол, и диализуют против того же буфера.

Хроматография на ДЭАЭ-сефадексе. Готовят колонку (1,5X40см), заполненную ДЭАЭ-сефадексом Л-25. Колонку уравновешивают указанным выше буфером. Наносят раствор белка (около 100 мг в 3 мл) и проводят элюцию тем же буфером, определяя во фракциях элюата содержание белка и активность фермента Фракции, содержащие наибольшую активность, объединяют и добавляют к ним сульфат аммония до концентрации 3,0 М. Доводят рН до 6,0. При этом около 90%

Г\ о гч

фермента выпадает в виде аморфного осадка. Периодическое (в течение нескольких часов) повышение температуры до 23° С приводит к постепенному преврашеиию аморфного осадка в кристаллический.

Метод II Реактивы:

1 Сульфат аммония, перекристаллизованный в присутствии ЭДТА (1,5 г/л).

2. Фосфат калия — 30 мМ раствор, содержащий 5 мМ ЭДТА и 1 мМ дитиотреитол, рН 7,0.

3. Ацетат натрия — 0,1 М раствор, доведенный уксусной кислотой до рН 5,6.

4. Трис — 1 М раствор.

5. Трис — 10 мМ раствор.

6. ЭДТА — 0,2 М раствор, доведенный 1 М трисом до рН 7,0.

7. ЭДТА — 0,2 М раствор, доведенный 1 М трисом до рН 7,5— 7,8.

8. Трис — 1 М раствор, доведенный морфолиноэтансульфоновой кислотой (MES) до рН 6,5.

9. Трис — 10 мМ раствор, доведенный MES до рН 6,5.

10 КОН — 10 мМ раствор, доведенный трицином до рН 7,9 и содержащий 3 мМ ацетат натрия.

11. КОН — 10 мМ раствор, доведенный трицином до рН 7,9 и содержащий 0,5 мМ 3-фосфоглицерат.

12. Сульфат аммония — насыщенный раствор, содержащий 30 мМ имидазол, 5 мМ ЭДТА и 2 мМ дитиотреитол, рН 7,0.

13 Имидазол — 30 мМ раствор, содержащий 5 мМ ЭДТА и 2 мМ дитиотреитол, рН 7,0.

14. Сефадекс G-50.

15. КМ-целлюлоза.

Все растворы готовят на бидистиллированной воде. Всю работу проводят при 2—4° С.

Экстракция. Измельченную мышечную массу (с. 291) заливают тремя объемами раствора экстракции: 30 мМ фосфата калия, 5 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотреитол, рН 7,0, и гомогенизируют 2—3 мин, после чего гомогенат сразу же

страница 133
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
напольные подставки для цветов
Чехол для миксера планетарного, полиэстер
работа в рекламе
ремонт vrv, vrf

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(25.05.2017)