химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

ьдегид-3-фосфатдегидроге-.назы.

Получение смеси 3-фосфоглицеринового альдегида

и фосфодиоксиацетона путем энзиматического расщепления

фруктозо-1,6-дифосфата

Метод основан на расщеплении фруктозо-1,6-дифосфата альдола-зой в присутствии гидразина. После разложения образующихся гидра-зонов бензальдегидом получают раствор свободных фосфотриоз, содержащий эквимолярные количества 3-фосфоглицеринового альдегида и фосфодиоксиацетона.

СН2—О—РО?~ I

C==N—NH2 I

СН2—ОН

+

С;—Н

IN—NH2 Н—С—ОН

I

СН2—О—РО3

Реактивы:

1. Кристаллическая альдолаза.

2. Фруктозо-1,6-дифосфат (освобожденный от ионов Ва2+ или Са2"^) — 0,07 М раствор, рН 7,5.

3. ЫаНСОз — 5%-ный (готовят непосредственно перед употреблением) .

4. Гидразин солянокислый (доводят до рН 7,0) — 2 М раствор.

5. Кальций уксуснокислый — 1 М раствор.

6. Бензальдегид.

7. Этиловый спирт, ацетон, эфир.

Получение гидразонов фосфотриоз. В зрленмейеровской колбочке смешивают 25 мл 0,07 М раствора фруктозо-1,6-дифосфата (рН 7,5), 10 мл 5%-ного раствора NaHC03, 6 мл раствора гидразина и 30 мл водного раствора альдолазы, содержащих 100 единиц активности, рН

30 мин, после чего в нее добавляют ' еще 20 мл раствора альдолазы (50 единиц активности) и 4 мл раствора гидразина. Инкубация продолжается еще 30 мин. За ходом расщепления фруктозодифосфата можно следить по убыли фруктозы. Реакцию останавливают добавлением трихлоруксусной кислоты в конечной концентрации 5%. Осадок белка удаляют центрифугированием.

Получение свободных фосфотриоз. Центрифугат сливаю! в делительную воронку и встряхивают с 20 мл бензальдегида. Слой бензальдегида сливают и встряхивание повторяют еще 3 раза. Затем бензаль-дегид удаляют 4-кратной экстракцией равным объемом эфира. К полученному раствору (раствор фосфотриоз можно хранить в замороженном состоянии в течение 7—12 дней) добавляют 10 мл 1 М раствора уксуснокислого кальция и 30 мл 95%-ного этилового спирта. Выпавший осадок отделяют центрифугированием. К центрифугату добавляют 20 мл 95%-ного этилового спирта и 200 мл ацетона, оставляют на ночь в холодильнике. Осадок собирают центрифугированием, промывают 95%-ным спиртом, затем эфиром, высушивают в вакуум-эксикаторе над хлористым кальцием и хранят в эксикаторе при 0—4° С. Для освобождения от ионов кальция используют смолу Дауэкс-50 R Н+-форме.

ЛИТЕРАТУРА

1. Szewczuk A., Wolny Е., Wolny М. et al. Nowa metoda otrzymywania D~ glyceraIdehyde-3-fosfoanu//Acta Biochem. Polon. 1961. Vol. 8. P. 201.

2. Meyerhof O., Junowicz-Kocholaty R. The equlibria of isomerase and aldolase and the problem of the phosphorylation of glyceraldehyde phosphate//J. Biol. Chem. 1943. Vol. 149. P. 71.

12. З-ФОСФОГЛИЦЕРАТКИНАЗА

(ЛТФ: З-фосфо-О-глицерат-1-фосфотрансфераза, КФ 2.7.2.3)

З-Фосфоглицераткиназа катализирует реакцию переноса фосфатной группы, находящейся в первом положении в молекуле 1,3-дифос-фоглицериновой кислоты, на АДФ с образованием АТФ и 3-фосфогли-цериновой кислоты.

0 О

I! 2 If

С—О—POf~ С—ОН

1 +АДФ-z± | + АТФ

Н—С—он н—с—он

I I

СН2-0-Р0з~ СН2-0-Р0з~

Молекулярная масса 3-фосфоглицераткиназы равна 47 000 Да; фермент представляет собой одну полипептидную цепь, состоящую из 420 аминокислотных остатков. З-Фосфоглицераткиназа из мышц кролика содержит семь SH-групп. Она ингибируется ионами тяжелых металлов и SH-реагентами, тогда как фермент из дрожжей имеет лишь одну SH-группу, модификация которой не влияет на активность. Ионы Mg2+ и Мп2+ являются активаторами. Константы Михаэлиса для 3-фосфоглицерата — 0,2 мМ, для 1,3-дифосфоглицерата — 1,8 мкМ„ для АТФ — 0,1 мМ; для АДФ — 0,2 мМ; для Mg2+ — 0,2 мМ.

определение активности 3-фосфоглицераткиназы

Активность 3-фосфоглицераткиназы определяют в сопряженной системе, используя в качестве вспомогательного фермента D-глицераль-дегид-3-фосфатдегидрогеназу, катализирующую реакцию восстановительного дефосфорилирования 1,3-дифосфоглицериновой кислоты:

3 фосфоглицераткиназа

3-фосфоглицериновая кислота + АТФ ( ~">"

^ 1,3-дифосфоглицериновая кислота

НАДН+Н*

глицерсльдегид 3 фосфатдегидрогеназа

3-фосфоглицериновый альдегид-}- НАД+-}-НОРОз

Скорость реакции измеряют по уменьшению поглощения при 340 нм.

Реактивы:

1. Триэтаноламиновый буфер — 100 мМ раствор, рН 7,5.

2. НАДН — 6 мМ раствор.

3. АТФ — 0,12 М раствор.

4 3-фосфоглицериновая кислота — 0,3 М раствор.

5. MgS04 — 0,2 М раствор.

6. Глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа. Кристаллическую суспензию растворяют в 5 мМ ЭДТА (рН 7,5) до получения раствора, содержащего 50 единиц активности (0,1 мл) (см. также с. 208).

Все растворы готовят на бидистиллированной воде.

Реакционная смесь должна содержать следующие компоненты (указаны конечные концентрации): 80 мМ триэтаноламиновый буфер (рН 7,5), 10 мМ MgS04, 0,2 мМ НАДН, 4 мМ АТФ, 10 мМ 3-фосфо-глицериновую кислоту и 10 ед. акт/мл глицеральдегид-3-фосфатдеги-дрогеназы. Реакцию начинают добавлением 30—50 мкл раствора 3-фосфоглицераткиназы.

Определение белка проводят спектрофотометри

страница 132
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
топпер для матраса
расценки на ремонт и то чиллеров
маленькие сковородки вок
мастерская по уличным номерам домов в воронеже

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(28.06.2017)