химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

еляют центрифугированием (20 мин при 1000g).

Фракционирование сульфатом аммония. К полученному экстракту ,(рН 7,0) добавляют при постоянном перемешивании небольшими порциями мелкоизмельченный сульфат аммония (50,5 г на 100 мл раствора). Доводят рН до 7,0—7,5 добавлением концентрированного аммиака. Через 30 мин выпавший осадок удаляют центрифугированием (60 мин при 30 000g). Доводят рН раствора до 7,8—8,0 и оставляют на ночь. Кристаллизация начинается сразу и продолжается в течение нескольких дней. Кристаллы отделяют центрифугированием (60 мин при 30000g) и суспендируют в растворе сульфата аммония насыщения 0,5, содержащем 5 мМ ЭДТА и 10 мМ дитиотреитол. Дальнейшая очистка фермента может проводиться следующими методами.

А. Перекристаллизация.

Осадок кристаллов растворяют в 5 мМ растворе ЭДТА с 0,5 мМ дитиотреитолом (рН 7,5) так, чтобы концентрация белка составляла 10—20 мг/мл. Нерастворившийся осадок отделяют центрифугированием. К прозрачному раствору медленно, при перемешивании на магнит

ной мешалке, добавляют мелко измельченный сульфат аммония из расчета 41,8 г на 100 мл раствора. Доводят рН до 8,5 добавлением разведенного аммиака. Кристаллизация продолжается в течение 5 дней. Перекристаллизацию проводят еще 2—3 раза. Если в ходе перекристаллизации не удается освободить препарат от примеси миоглобина, окрашивающей его в розовый цвет, то раствор белка (40 мг/мл) пропускают через колонку (1,5x70 см), заполненную сефадексом G-100, уравновешенную 0,05 М раствором пирофосфата натрия с 1 мМ ЭДТА и 0,2 мМ дитиотреитолом, рН 8,5- Собирают фракции при скорости тока 0,6 мл/мин. Фермент выходит первым пиком, его раствор имеет слабо-желтую окраску. Добавлением сухого сульфата аммония вызывают кристаллизацию.

Б. Ионообменная хроматография.

Кристаллы фермента, полученные из 300 г мышц, растворяют в буфере: 5 мМ MOPS, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотреитол, рН 6,4 (до концентрации 50—60 мг/мл). Прозрачный темно-красный раствор обессоливают пропусканием через колонку (4x40 см), заполненную сефадексом G-50 (тонкий) и уравновешенную тем же буфером. Обессоленный раствор белка наносят на колонку (4X40 см), заполненную КМ-сефа-дексом (G-25) и уравновешенную вышеуказанным буфером при рН 6,4. Тем же буфером промывают колонку до появления белка в элюате, после чего начинают элюцию фермента с помощью раствора: 5 мМ MOPS, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотреитол, 0,1 М сульфат аммония, рН 7,5. Скорость элюции — 3—4 мл/10 мин. Фермент выходит с колонки размытым пиком. Объединяют фракции, содержащие активность глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и имеющие концентрацию белка 7—10 мг/мл (всего около 100 мл); рН раствора должен быть около 6,5. К раствору белка добавляют НАД+ в конечной концентрации 1 мМ; добавление НАД+ целесообразно, если раствор имеет Л28оМ2бо>1,1- Доводят рН раствора до 7,0 разведенным аммиаком и добавляют к нему сухой сульфат аммония из расчета 50 г на 100 мл. Кристаллизация завершается в течение 5 дней. Кристаллы хранят в виде суспензии в полунасыщенном растворе сульфата аммония в присутствии 20 мМ дитиотреитола при 2—4°С.

Получение апофермента. Для отщепления НАД+, прочно связанного с мышечной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой, препарат фермента обрабатывают норитом (активированный уголь), 500 мг норита суспендируют в 10 мл 10 мМ фосфата натрия, содержащего 5 мМ ЭДТА, рН 7,2. Через 2—3 мин надосадочную жидкость декантируют для удаления мелких частиц норита. Эту процедуру повторяют 2—3 раза, после чего осадок норита отделяют центрифугированием (1000g, 4 мин). К влажному осадку норита добавляют 1,5 мл раствора фермента (концентрация белка 10—20 мг/мл). Суспензию перемешивают 1 мин, затем норит отделяют центрифугированием, а раствор белка пропускают через колонку с сефадексом G-50, уравновешенную 10 мМ фосфатом натрия, 5 мМ ЭДТА, рН 7,2.

Выделение глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из пекарских дрожжей

Реактивы:

1. ЭДТА — 5 мМ раствор, рН 7,5.

2. Сульфат аммония, церекристаллизованный в присутствии ЭДТА (1,5 г/л).

3. Сульфат аммония — насыщенный раствор, рН 8,2.

4. Сульфат аммония — 2,4 М раствор, рН 7,5.

5. Толуол.

6. Аммиак.

Все растворы готовят на 5 мМ растворе ЭДТА, приготовленном на бидистиллирЪванной воде.

Экстракция. В колбу объемом 3 л, содержащую 600 мл нагретого до 40° С толуола, добавляют 1 кг измельченных свежих пекарских дрожжей. Смесь инкубируют на водяной бане при 45° С до разжижения, периодически помешивая, и затем оставляют при комнатной температуре. Через 3 ч переливают смесь в толстостенный стакан объемом 5 л, добавляют 1 л охлажденного 5 мМ раствора ЭДТА (рН 7,5), перемешивают и оставляют на 16 ч при 3°С (стакан необходимо плотно закрыть крышкой для уменьшения испарения толуола). Всю последующую работу проводят в холодной комнате или на ледяной бане.

С помощью сифона отделяют нижний слой жидкости, представляющий собой дрожжевой экстракт. Его вначале центрифугируют (5000 60 мин), а затем фильтруют на воронке Бухнера большого диаметра через плотный слой мезги. Мезгу готовят след

страница 130
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
мягкое оборудование в екатеринбурге
котлы жмз
Хлебницы Joseph Joseph купить
авито детский лабиринт

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(05.12.2016)