химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

лицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы

Активность глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы измеряют спектрофотометрически по нарастанию (в прямой реакции) или по уменьшению (в обратной) поглощения при 340 нм. Ниже приводится только первый вариант.

Реактивы:

1. Буфер: 0,1 М глициновый или 40 мМ триэтаноламиновый, рН 8,9 (фермент из мышц кролика) либо 50 мМ пирофосфатныщ рН 8,3 (фермент из пекарских дрожжей).

2. Na2HP04 — 0,5 М раствор.

3. Na3As04 — 50 мМ раствор.

4. 3-фосфоглицериновый альдегид — 10 мМ раствор.

5. НАД+ — 10 мМ раствор.

6. ЭДТА — 50 мМ раствор.

Все растворы готовят на бидистиллированной воде.

В спектрофотометрическую кювету помещают 2 мл соответствующего буферного раствора, а также НАД+ (конечная концентрация 1 мМ), фосфат натрия (конечная концентрация 50 мМ) либо арсенат натрия (конечная концентрация 5 мМ), ЭДТА (конечная концентрация 5 мМ), 1—2 мкг фермента. Объем пробы доводят до 3 мл (концентрации компонентов реакционной смеси рассчитаны на этот объем). Реакцию начинают добавлением 3-фосфоглицеринового альдегида в объеме 20—30 мкл.

Определение белка проводят спёктрофотометрически, учитывая, что поглощение раствора фермента при 280 нм зависит от количества НАД+, связанного с белком. Существуют следующие соотношения между ЛгвоМгбо и коэффициентами зкстинкции:

Выделение фермента из скелетных мышц кролика

Метод I Реактивы:

1. Сульфат аммония, перекристаллизованный в присутствии ЭДТА (1,5 г/л).

2. ЭДТА — 50 мМ раствор, содержащий 0,2 мМ дитиотреитол, доведенный аммиаком до рН 8,4.

3. ЭДТА — 5 мМ раствор, содержащий 0,2 мМ дитиотреитол, рН 7,6.

4. Аммиак.

Все растворы готовят на бидистиллированной воде. Работу проводят при 2—4° С.

Экстракция. Измельченные мышцы (с. 221) заливают равным объемом 50 мМ ЭДТА, содержащим 0,2 мМ дитиотреитол и доведенным до рН 8,4 концентрированным аммиаком. Перемешивают механической мешалкой в течение 20 мин. Мышечную массу отделяют центрифугированием при 1000g в течение 20 мин. Экстракцию повторяют еще дважды, используя каждый раз 0,5V раствора ЭДТА с дитиотреито-лом; рН объединенного экстракта должен быть около 7,1 (при 0°С),

Фракционирование сульфатом аммония. К экстракту медленно добавляют сухой сульфат аммония в количестве 300 г/л. Через 1 ч после добавления последней порции соли осадок отделяют центрифугированием (20 000g, 30 мин) и к супернатанту вновь добавляют сухой сульфат аммония (117 г/л). После стояния в течение часа осадок отделяют центрифугированием (20 000 g, 30 мин) и к супернатанту добавляют сульфат аммония (13 г/л); оставляют на ночь при 0° С. В процессе высаливания стараются свести к минимуму вспенивание раствора; образующуюся пену удаляют пипеткой. В ходе фракционирования поддерживают рН раствора в диапазоне 7,3—7,6 (при 0°С) путем добавления аммиака. В том случае, если на последней стадии осадок не образуется, добавляют еще сухого сульфата аммония (13 г/л).

Повторное фракционирование. Осадок, собранный центрифугированием (20000g\ 30 мин), растворяют в минимальном объеме смеси; 5 мМ ЭДТА, 0,2 мМ дитиотреитол и доводят до рН 7,6 раствором аммиака. Раствор белка подвергают диализу против смеси того же состава, после чего добавляют к нему сухой сульфат аммония (0,39 г/мл). При этом образуется гелеобразный осадок, который после часового стояния отделяют центрифугированием (20000gy 30 мин). Осадок вновь растворяют в минимальном объеме 5 мМ ЭДТА с дитиотреито-лом и диализуют, как описано выше. Вновь добавляют сухой сульфат аммония (0,20 г/мл). Через час отделяют осадок, если он обраЗОваЛся, и отбрасывают его. К прозрачному супернатанту добавляют сульфат аммония (0,15 г/мл). Через час отделяют центрифугированием гелеобразный осадок фермента. В ходе повторного фракционирования постепенно исчезает красный цвет белковых фракций. Полученный препарат фермента хранят в виде суспензии в полунасыщенном растворе сульфата аммония в присутствии 20 мМ дитиотреитола при 0—3° С.

Метод II

Реактивы:

1. Сульфат аммония, перекристаллизованный в присутствии ЭДТА (1,5 г/л).

2. КОН — 30 мМ раствор, содержащий 5 мМ ЭДТА и 0,5 мМ дитиотреитол.

3. Аммиак.

4. Сульфат аммония — насыщение 0,5, содержит 5 мМ ЭДТА и 10 мМ дитиотреитол.

5. ЭДТА — 5 мМ раствор рН 7,5, содержащий 0,5 мМ дитиотреитол,

6. Пирофосфат натрия — 50 мМ раствор, содержащий 1 мМ ЭДТА и 0,2 мМ дитиотреитол, рН 8,5.

7. MOPS — 5 мМ раствор, содержащий 5 мМ ЭДТА и 1 мМ дитиотреитол, рН 6,4.

8. MOPS — 5 мМ раствор, содержащий 1 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотреитол и 0,1 М сульфат аммония, рН 7,5.

9. Сефадексы: G-100 (для гельфильтрации), G-50 (тонкий), КМсефадекс (G-25).

10. НАД+.

Все растворы готовят на бидистиллированной воде. Всю работу проводят при 2—4° С.

Экстракция. Измельченную мышечную массу заливают двойным (по весу) объемом экстрагирующего раствора (30 мМ КОН, 5 мМ ЭДТА, 0,5 мМ дитиотреитол) и гомогенизируют с помощью блендера в течение 1 мин. Полученный гомогенат перемешивают на механической мешалке в течение 15—20 мин. Экстракт отд

страница 129
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
экспрес курс по дизайну интерьера
rev.crema mate liso
huppe поддон купить
курсы фотошоп белгород

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(08.12.2016)