химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

М гидроокиси аммония перемешивают при комнатной температуре в течение 20 ч, добавляют 1,2 л воды, 34 мл 0,5 М раствора ЭДТА и отдельными порциями, при перемешивании, сульфат аммония до 0,35 М концентрации.

Тепловая обработка. Полученную суспензию отдельными порциями нагревают до 60 °С в водяной бане на 80—85° С, затем на 10 мин помещают в водяной термостат при 60° С. Центрифугируют 20 мин при 15 000g и осадок отбрасывают.

Фракционирование сульфатом аммония. К центрифугату в течение 6 ч при перемешивании добавляют сульфат аммония до 1,3 М концентрации, продолжают перемешивание при комнатной температуре еще 2 ч. Центрифугируют при 15 000 g в течение 10 мин, осадок отбрасывают, а к центрифугату, как и в первый раз, но теперь уже в течение 4 ч добавляют сульфат аммония до 2,9 М концентрации и остав9^1

ляют на ночь в холодильнике. Центрифугируют 20 мин при 40 000^ и осадок растворяют в 200 мл холодной бидистиллированной воды.

Фракционирование метанолом. К ферментному раствору при перемешивании добавляют в течение 3 ч 110 мл ледяного метанола, центрифугируют 10 мин при 40 000g и осадок отбрасывают. Центрифугат упаривают наполовину в роторном испарителе при 20 °С и добавляют к нему при перемешивании 53 г сульфата аммония. Перемешивание продолжают при 20°С еще 2 ч, центрифугируют 20 мин при 40 000я» осадок растворяют в минимальном объеме холодной воды и диализу-ют в течение ночи против 5 л воды при перемешивании.

Обработка протаминсульфатом. К отдиализованному раствору добавляют по каплям, при перемешивании, раствор протаминсульфата до прекращения образования осадка, после чего центрифугируют 10 мин при 40 000 g и осадок отбрасывают.

Хроматографирование на ДЭАЭ-сефадексе и кристаллизация. К. центрифугату при перемешивании добавляют сульфат аммония до насыщения 0,9. Центрифугируют 20 мин при 40 000 g, осадок растворяют в минимальном объеме холодной воды, диализуют в течение ночи против 5 л воды при помешивании и наносят на колонку ДЭАЭ-сефа-декса Л-25 (65x4,5 см), уравновешенную 10 мМ триэтаноламин-НС1-буфером, рН 8,0. Фермент элюируют при комнатной температуре линейным градиентом хлористого натрия (от 0 до 0,15 М) в буфере, используя для этого 1,5 л 10 мМ триэтаноламин-НС1-буфера, рН 8,0, и 1,5 л 0,15 М хлористого натрия, приготовленного на том же буфере. Триозофосфатизомераза обычно начинает сходить с колонки после пропускания 1,5 л элюирующего раствора и собирается в объеме примерно 500 мл. Основные фракции пика (около 90% активности) объединяют; осторожно, небольшими порциями, при перемешивании добавляют сульфат аммония до слабого помутнения и оставляют в холодильнике. Кристаллизация обычно начинается в течение 12 ч.

Хроматографирование на КМ-сефадексе и перекристаллизация. Суспензию кристаллов центрифугируют 20 мин при 40 000 g, осадок растворяют в минимальном объеме холодной воды, диализуют, как указано выше, и наносят на колонку КМ-сефадекса С-50 (60X4,5 см), уравновешенного 10 мМ фосфатным буфером, рН 6,5. Триозофосфати-зомеразу элюируют при комнатной температуре линейным градиентом хлористого натрия (от 0 до 0,15 М) в буфере, используя для этого 800 мл 10 мМ фосфатного буфера, рН 6,5, и 800 мл 0,15 М. хлористого натрия в том же буфере. Обычно после пропускания 300 мл элюирующего раствора фермент начинает сходить с колонки и собирается примерно в 200 мл.

Фракции, содержащие основное количество триозофосфатизомеразы, объединяют, добавляют при перемешивании 0,5 М ацетатный буфер до рН 6,0, затем сульфат аммония до слабого помутнения и оставляют в холодильнике. В течение суток фермент обычно начинает кристаллизоваться. По окончании кристаллизации суспензию центрифугируют 20 мин при 40 000 g и осадок суспендируют в минимальном объеме 10 мМ фосфатного буфера, рН 6,5, содержащего 2,5 М сульфат аммония. В холодильнике препарат сохраняет свою активность по крайней мере в течение двух лет.

ЛИТЕРАТУРА

N о 11 m a n n Е. A. Aldose-Ketose Isomerase//The Enzymes. N. Y., 1972. Vol. 6. P. 326.

10. ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-З-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗА

(D-глицеральдегид-З-фосфат: НАДи-оксидоредуктаза фосфорилирующая, КФ 1.2.1.12)

Тлицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа (ГАФД) катализирует реакцию окисления глицеральдегид-3-фосфата, сопряженную с фосфо-рилированием:

н о—го!"

I I

с=о с=о

| + Н3Р04 + НАД+^: i +НАДН + Н+

н-с—он н-с—он

СН2—О—РОз~ СН2—0-РОз~

Глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа — тетрамер (м. м.= 144 000 Да), построенный из химически идентичных субъединиц. Центральную роль в катализе выполняет цистеиновый остаток. Фермент ингибируется ионами тяжелых металлов. Константы Михаэлиса гли-церальдегид-3-фосфатдегидрогеназы из мышц кролика: для НАД+ — 13 мкМ, для глицеральдегид-3-фосфата — 90 мкМ, для фосфата — 0,29 мМ; для фермента из дрожжей: для НАД+ — 44 мкМ, для гли-церальдегид-3-фосфата — 160 мкМ, для Фн — 0,3 мМ; АМФ, АДФ, АТФ являются коэнзим-конкурентными ингибиторами. В знзиматиче-ской реакции фосфат может быть заменен на арсенат, что делает реакцию необратимой.

Определение активности г

страница 128
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
SUPER SGA (S/SGA) купить
31 июля manson
Стол Sigma Drive Cattelan Italia
опасная бритва набор купить

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(24.02.2017)