химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

М, а для диокси-ацетоифосфата — 1,23Х10_3 М. Л1%1см при 280 нм равна 9,9.

Определение активности триозофосфатизомеразы

Активность триозосфосфатизомеразы можно измерять по убыли или образованию НАДН в зависимости от того, используется ли в качестве субстрата глицеральдегид-3-фосфат, а в качестве вспомогательного фермента — глицерол-3-фосфатдегидрогеназа или соответственно диоксиацетонфосфат и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа. В обоих случаях за ходом реакции следят спектрофотометрически, определяя изменение оптической плотности при 340 нм (с. 7).

Вариант I Реактивы:

1. Триэтаноламиповый буфер — 0,1 М раствор, рН 7,5.

2. Триэтаноламиповый буфер — 10 мМ раствор, рН 7,5.

3. НАДН — 14 мМ раствор, рН 8,0.

П/П

4. Z^-L-глицеральдегид-З-фосфат — 90 мМ раствор, рН 5,0. К препарату бариевой соли D-L-глицеральдегид-З-фосфатдиэтилаце-тата, суспендированному в небольшом объеме воды, добавляют Дауэкс-50 в Н+-форме, 200—400 меш. (1 г на каждые 80 мг бариевой соли), интенсивно встряхивают до растворения соли и помещают на 3,5 мин в кипящую водяную баню. Затеи фильтруют с отсасыванием и осадок промывают водой, объем которой должен быть равен тому объему воды, в котором суспендировали исходную соль. Промывные воды объединяют с основным фильтратом, добавляют мелкоизмельченный бикарбонат натрия до рН 5,0 и доводят водой до нужного объема. Хранят в замороженном состоянии. Можно использовать кальциевую соль D-глицеральдегид-З-фосфата, переводя ее предварительно в натриевую.

5. Глицерол-З-фосфатдегидрогеназа — 70 Е/мл, свежеприготовленный раствор на 10 мМ триэтаноламиновом буфере, рН 7,5. В нем не должно содержаться сульфата аммония, который ингибирует триозофосфатизомеразу.

6. Триозофосфатизомераза — 0,4 Е/мл, свежеприготовленный раствор на 10 мМ триэтаноламиновом буфере, рН 7,5.

В спектрофотометрическую кювету помещают реакционную смесь,, содержащую (указаны конечные концентрации) 80 мМ буфер, 0,25 мМ НАДН, 0,1 мл глицеральдегид-3-фосфата и 0,05 мл глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы. Перемешивают и устанавливают величину оптической плотности при 340 нм по шкале спектрофотометра на отметке 0,4—0,5. Добавляют 0,05 мл триозофосфатизомеразы (общий объем пробы —• 3 мл), перемешивают и измеряют уменьшение оптической плотности в течение 3—5 мин. В контрольную кювету вместо триозофосфатизомеразы добавляют соответствующий объем 10 мМ триэтаноламинового буфера, рН 7,5.

Вариант II Реактивы:

1. Тризтаноламиновый буфер — 7,5 мМ раствор, рН 7,6.

2. Тризтаноламиновый буфер — 30 мМ раствор, рН 7,6.

3. ЭДТА — 30 мМ раствор, рН 7,6.

4. Диоксиацетонфосфат — 75 мМ раствор, рН 6,0.

5. НАД — 6 мМ раствор, рН 6,0. Может несколько дней храниться в холодильнике.

6. Арсенат натрия — 78 мМ раствор.

7. Глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа (освобожденная от сульфата аммония), не содержащая триозофосфатизомеразы и глицерол-3-фосфатдегидрогеназы — 75 Е/мл, свежеприготовленный раствор на 30 мМ триэтаноламиновом буфере.

8. Триозофосфатизомераза — 2 Е/мл, свежеприготовленный раствор на 30 мМ триэтаноламиновом буфере.

В спектрофотометрическую кювету помещают реакционную смесь, содержащую (указаны конечные концентрации) 30 мМ буфер, 1 мМ

пгл

ЭДТА, 5 мМ диоксиацетонфосфат, 0,3 мМ НАД, 13 мМ арсенат натрия, 0,04 мл глицеральдегидфосфатдегидрогеназы и 0,01 мл триозо-фосфатизомеразы (общий объем пробы — 3 мл). Перемешивают и в течение 3—5 мин измеряют увеличение оптической плотности при 340 нм. В контрольную кювету вместо раствора триозофосфатизомеразы добавляют соответствующий объем 30 мМ триэтаноламинового буфера.

Арсенат оказывает ингибирующее действие на триозофосфатизоме-разу, поэтому первый способ определения активности предпочтительнее.

Выделение фермента из дрожжей

Реактивы:

1. Гидроокись аммония — 1 М раствор.

2. ЭДТА — 0,5 М раствор.

3. Сульфат аммония, порошок.

4. Метанол.

5. Протаминсульфат — раствор, содержащий 2 г протаминсуль-фата и 3,2 мл 0,1 М натриевой щелочи в 100 мл воды.

6. Триэтаноламин-НС1-буфер — 10 мМ раствор, рН 8,0.

7. ДЭАЭ-сефадекс А-25, уравновешенный 10 мМ триэтаноламин-HCl-буфером, рН 8,0 (с. 109).

8. Триэтаноламин-НС1-буфер — 10 мМ раствор, содержащий 0,15 М хлористый натрий, рН 8,0.

9. Фосфатный буфер — 10 мМ раствор, рН 6,5.

10. КМ-сефадекс С-50, уравновешенный 10 мМ фосфатным буфером, рН 6,5 (с. 109).

11. Фосфатный буфер — 10 мМ раствор, содержащий 0,15 М хлористый натрий, рН 6,5.

12. Ацетатный буфер — 0,5 М раствор, рН 4,6.

13. Сульфат аммония — 2,5 М раствор, приготовленный на 10 мМ фосфатном буфере, рН 6,5.

Подготовка исходного материала. Пивные или пекарские дрожжи несколько раз промывают водопроводной водой, центрифугируют в рефрижераторной центрифуге 10—15 мин при 18000g и сушат на воздухе при комнатной температуре, помещая их на металлическую сетку, покрытую листами фильтровальной бумаги. Сухие дрожжи хранят в герметической упаковке на холоде. Перед использованием измельчают в шаровой мельнице.

Экстракция. 260 г сухих дрожжей и 490 мл 1

страница 127
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
специалист кип по газовому оборудованию обучение
медикаментозный аборт мифепристон
http://www.prokatmedia.ru/ekran.html
расместить рекламу на автомобиль

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(23.06.2017)