химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

тивности альдолазы этим способом основано на применении сопряженной системы, в которой в качестве вспомогательного фермента используется глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (ГАФД):

>фруктозо-1,6-дифосфат альдолаза->- 3-фосфоглицериновый альдегид +фосфодиоксиацетон

НАД+ ГАФД

HOAsOlт

1 -As-3-фосфоглицериновая кислота + НАДН4-Н+

Реактивы:

1. Тризтаноламиновый буфер — 0,1 М раствор рН 8,0, содержащий 5 мМ ЭДТА.

2. Фруктозо-1,6-дифосфат — 2 мМ раствор, рН 8,0.

3. НАД+ — 50 мМ раствор.

4. Арсенат натрия ?— 00 мМ раствор.

5. Глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа. Кристаллическую суспензию растворяют в 5 мМ ЭДТА (рН 7,5) до получения раствора, содержащего 10 единиц активности/0,1 мл (см. также с. 253).

В спектрофотометрическую кювету помещают 2 мл 0,1 М триэта-' ноламинового буфера, рН 8,0, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (30 единиц активности), а также растворы фруктозо-1,6-дифосфата (0,2 мМ), НАД+ (3 мМ) и арсената натрия (5 мМ) с таким расчетом, чтобы после доведения объема пробы до 3 мл их конечные концентрации соответствовали величинам, указанным в скобках. После перемешивания начинают реакцию добавлением 30—50 мкл раствора альдолазы. Отмечают нарастание поглощения при 340 нм.

Определение белка проводят спектрофотометрически, учитывая,

что A — J0/cm для альдолазы соответствует 9,1 при 280 нм.

Выделение альдолазы из скелетных мышц кролика

Реактивы:

1. Сульфат аммония (перекристаллизованный в присутствии ЭДТА) — насыщенный раствор, рН 7,5.

2. Сульфат аммония — насыщенный раствор, рН 5,7.

3. ЭДТА — 5 мМ раствор, рН 7,5.

4. Аммиак.

Все растворы готовят на бидистиллированной воде.

Экстракция. К 250—300 г мышечной массы кролика (с. 221) добавляют равный объем охлажденного 5 мМ раствора ЭДТА и перемешивают в течение 10 мин, после чего центрифугируют (20 мин при 10 000g). Экстракцию повторяют, используя такое же количество раствора ЭДТА. Экстракты соединяют.

Фракционирование сульфатом аммония. Доводят рН экстракта до 7,5 холодным разведенным аммиаком. Добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония (рН 7,5), осторожно перемешивают и оставляют на 15 мин на холоде. Последующие этапы работы проводят в холодной комнате. Центрифугируют (20 мин при 15 000 g). Супернатант доводят до насыщения 0,52 (добавлением 4 мл насыщенного раствора сульфата аммония, рН 7,5, на каждые 100 мл раствора); рН доводят аммиаком до 8,0—8,1. Альдолаза кристаллизуется в течение нескольких часов или нескольких дней. Начало кристаллизации может быть ускорено постепенным нагреванием раствора до комнатной температуры с последующим охлаждением до 0—5° С.

Перекристаллизация. Осадок отделяют центрифугированием (20 мин при 15 000^) и растворяют в 5 мМ ЭДТА, рН 7,0, до получения концентрации белка 20—30 мг/мл. Медленно, при осторожном перемешивании, добавляют насыщенный раствор сульфата аммония (рН 7,5) до появления аморфного осадка, который удаляют центрифугированием. К центрифугату продолжают добавлять насыщенный раствор сульфата аммония до начала кристаллизации. Перекристаллизацию можно повторить. Кристаллы альдолазы хранят на холоде в полунасыщенном растворе сульфата аммония

Кристаллизация в виде бипирамид. К прозрачному раствору, приготовленному путем растворения кристаллов альдолазы (имеющих форму пластинок) и содержащему 15—20 мг белка/мл, добавляют на

холоде насыщенный раствор сульфата аммония (не нейтрализованный, имеющий рН 5,7) до небольшого помутнения. При этом рН раствора альдолазы должен быть около 6,0. Через 20—48 ч появляются кристаллы, имеющие форму бипирамид. Препарат фермента хранят на холоде в виде суспензии в сульфате аммония при насыщении 0,6.

ЛИТЕРАТУРА

1. Horecker В. L., Tsolas О., Lai С. Y. Aldolases//The Enzymes. N. Y., 1972. Vol. 7. P. 213.

2. T i n g S. M., S i a C. L. et al. Frog muscle aldolase: purification of the enzyme and structure of the active site//Arch. Biochem. Biophys. 1971. Vol. 144. P. 485.

3. Chappel A., Hoogenraad N. J., Holmes R. S. Purification and properties of the native form of rabbit liver aldolase//Biochem. J. 1975. Vol. 175. P. 377.

9. ТРИОЗОФОСФАТИЗОМЕРАЗА

(D-глицеральдегид-З-фосфат-кетолизомераза, КФ 5.3.1.1)

Триозофосфатизомераза — фермент гликолиза, катализирует обратимую реакцию превращения ?>-глицеральдегид-3-фосфата в диокси-ацетонфосфат:

НСО Н2СОН

I I

неон -—>? со

I [

НаС—О—Р03Н2 СН2—О—Р03Н3

Фермент относят к классу изомераз. Он широко представлен в природе. Для своего действия не требует наличия кофакторов.

Триозофосфатизомераза пивных дрожжей имеет молекулярную массу 53 000 Да, состоит из двух неидентичных субъединиц. Оптимум рН в триэтаноламин-НС1-буфере — 7,0—8,5 и 7,6—9,5 соответственно при определении активности с использованием в качестве вспомогательного фермента глицерол-3-фосфатдегидрогеназы или глицеральде-гид-3-фосфатдегидрогеназы. Константа равновесия реакции изомеризации ?>-глицеральдегид-3-фосфата при рН 7,5 и 25°С равна 19. Km для этого субстрата при тех же условиях — 1,27хЮ-3

страница 126
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
http://taxiru.ru/laytboks-u/
наклейки на подоконник цветы
http://www.prokatmedia.ru/plazma.html
обследование при скв

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(23.07.2017)