химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

исано выше. Первые порции элюата, собранные сразу после выхода свободного объема колонки, содержат фермент. Этот раствор выдерживают в течение 2,5 ч при 0—4° С. Образующийся осадок собирают центрифугированием (18 000 об/мин, 30 мин). Супернатант отбрасывают (предварительно проверяют на ферментативную активность).

Промывание осадка. Осадок суспендируют в буфере 25 мМ трис-HCl — 30 мМ KF, рН 7,2 (примерно в 40 мл). Суспензию центрифугируют при 11 500g" в течение 10 мин. Осадок промывают еще раз. Затем осадок суспендируют в 50 мМ трис-HCl буфере, рН 8,0 (примерно в 4 мл), осторожно перемешивают 2—3 мин и центрифугируют при II 500g в течение 10 мин. Процедуру промывания повторяют еще два раза.

Солюбилизация АТФ. Промытый осадок растворяют в 3 мл (в расчете на 400 г мышц, использованных для экстракции фермента) 10 мМ раствора АТФ, рН 7,2. Нерастворившийся белок отбрасывают центрифугированием при 11 500? в течение 10 мин. Супернатант, содержащий фосфофруктокиназу, разливают на несколько порций и хранят при —70° С.

использовать другие эффекторы, такие, как фруктозо-6-фосфат (5 мМ), (NH4)2S04 (50%), неорганический фосфат (50 мМ), однако наиболее эффективным действием обладает 10 мМ АТФ, рН 7,2. При той же концентрации АТФ, но при рН 8,0 растворимость фермента значительно меньше.

Примечание. Чтобы избежать агрегации фермента на колонке во время гель-фильтрации, необходимо наносить не менее 30% объема исследуемого раствора от объема колонки.

Метод III

Реактивы:

1. К-Фосфатный буфер — 10 мМ раствор, рН 7,5, содержащий 30 мМ KF и 3 мМ ЭДТА.

2. NH4OH — 4 М раствор.

3. Сульфат аммония (сухой, перекристаллизованный из 5 мМ раствора ЭДТА, рН 8,2, мелко измельченный).

4. Трис-фосфатный буфер — 50 мМ раствор, рН 8,0, содержащий I мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотреитол и 0,2 мМ фруктозо-1,6-дифос-фат (буфер А).

5. Трис-фосфатный буфер — 50 мМ раствор, рН 8,0, содержащий 1 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотреитол, 0,2 мМ фруктозо-1,6-дифосфат и 1 М (NH4)2S04 (буфер Б).

6. Трис-фосфатный буфер — 50 мМ раствор, рН 8,0, содержащий 0,1 мМ ЭДТА (буфер В).

7. Трис-фосфатный буфер — 0,3 М раствор, рН 8,0, содержащий 0,1 мМ ЭДТА.

8. Биогель А — 1,5 m (или сефароза 4В).

9. ДЭАЭ-сефадекс А-50.

Растворы готовят на бидистиллированной воде. Трис перекристал-лизовывают, как указано выше (с. 241). Работу проводят при 0—4° С.

Получение экстракта. Измельченную мышечную массу (с. 221) взвешивают, добавляют тройной объем К-фосфатного буфера — 10 мМ (рН 7,5), содержащего 30 мМ KF и 3 мМ ЭДТА и гомогенизируют 30 с. Перемешивают 5—10 мин и центрифугируют 50 мин при 10 000g\ Супернатант доводят до рН 7,5 добавлением 4 М NH4OH.

Фракционирование сульфатом аммония. К супернатанту медленно добавляют сухой сульфат аммония при постоянном перемешивании до 45%-ного насыщения. Продолжают перемешивание в течение часа и оставляют на ночь. Центрифугируют 50 мин при 10 000g. Осадок отбрасывают. К супернатанту добавляют сульфат аммония до 55%-ного насыщения. Продолжают перемешивание в течение часа. Осадок, содержащий фосфофруктокиназу, собирают центрифугированием (30 мин при 15 000g") и осторожно суспендируют в минимальном объеме буфера А.

Гель-хроматография. Раствор фосфофруктокиназы наносят на колонку (4x50 см), заполненную биогелем А—1,5т, предварительно уравновешенную буфером Б. Этим же буфером проводят элюцию белка с колонки. Во фракциях измеряют концентрацию белка и ферментативную активность. Фракции белка, содержащие наибольшую активность, объединяют. К объединенному раствору добавляют сульфат аммония до 55%-ного насыщения. Продолжают перемешивание в течением (20 мин при 15 ООО^f) и осторожно растворяют в буфере А, используя минимальный объем раствора.

Повторная гель-хроматография. Раствор фосфофруктокиназы наносят на колонку (2,2x60 см), заполненную биогелем А—1,5т, уравновешенную буфером А. Фермент злюируют тем же буфером. Фракции с наибольшей удельной активностью объединяют.

Фракционирование сульфатом аммония. К объединенному раствору добавляют сульфат аммония при постоянном перемешивании до 60Ясного насыщения. Продолжают перемешивание в течение часа. После центрифугирования (20 мин при 15 ООО g) осадок суспендируют в минимальном объеме буфера В. Суспензию диализуют против 20-кратного объема того же буфера не менее 8 ч.

Ионообменная хроматография. После диализа раствор наносят на колонку (4x20 см), заполненную ДЭАЭ-сефадексом А-50, уравновешенную буфером В. Колонку промывают тем же буфером (500 мл), после чего проводят элюцию 0,3 М трис-фосфатным буфером, рН 8,0, содержащим 0,1 мМ ЭДТА (500 мл). Фракции, содержащие фермент, объединяют и добавляют сульфат аммония до 80%-ного насыщения. Продолжают перемешивание в течение часа, центрифугируют (20 мин лри 15 000 g"). Осадок осторожно суспендируют в буфере В, насыщенном сульфатом аммония, и хранят при 4° С.

Примечание. При замене одного буферного раствора на другой раствор белка пропускают через колонку (1,2x10 см), заполненную сефадексом G-25.

Указанные размеры колонок при гель-хромато

страница 124
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
уличные игровые комплексы в астрахани купить
продажа домашний кинотеатр 3д
http://www.prokatmedia.ru/sound.html
swiss diamond induction

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(27.07.2017)