химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

количества изопропилового спирта продолжают перемешивание в течение 30 мин при —5° С. Осадок собирают центрифугированием

(30 мин, 10 ООО g при —5"С) и растворяют в 0,1 мм трис-фосфатном буфере, рН 8,0, содержащем 0,2 мМ ЭДТА, 0,2 мМ фруктозо-1,6-ди-фосфат (примерно в 1/15 от объема первой фракции, полученной после экстракции). Суспензию диализуют против того же буфера в течение ночи

Тепловая обработка. Помещают суспензию в водяную баню, нагретую до 70 °С. При постоянном перемешивании температуру суспензии доводят до 57°С (59°С), выдерживают 3 мин и быстро охлаждают в сосуде со льдом до 5° С. После центрифугирования (20 мин при 4° С, при 16 000 g) осадок еще раз суспендируют в небольшом объеме трис-фосфатного буфера и центрифугируют, как прежде. Супернатанты объединяют.

Фракционирование сульфатом аммония. Объединенный супернатант помещают в сосуд с тающим льдом и при постоянном перемешивании добавляют сульфат аммония до 38%-ного насыщения (21,3 г на 100 мл). Продолжают перемешивание еще 30 мин, после чего центрифугируют 20 мин при 10 000 g. Осадок отбрасывают. К супернатанту добавляют сульфат аммония до 55%-ного насыщения (10,1 г на 100мл). Осадок, содержащий фермент, собирают центрифугированием и растворяют в небольшом объеме 50 мМ Na-p-глицерофосфатного буфера (рН 7,2), содержащего 2 мМ ЭДТА, 2 мМ АТФ и сульфат аммония при 38%-ном насыщении. Проводят диализ против того же буфера.

Кристаллизация. Осадок, образующийся в первые 4 ч диализа, удаляют центрифугированием. Кристаллизация начинается примерно через неделю. Через несколько дней после начала кристаллизации диализный мешочек переносят в буфер того же состава, но содержащий сульфат аммония при 40%-ном насыщении и оставляют до окончания кристаллизации.

Перекристаллизация. Кристаллическую суспензию фосфофруктокиназы центрифугируют. Кристаллы растворяют в Na-fJ-глицерофос-фате — ЭДТА—АТФ, рН 7,2. Нерастворившийся осадок отбрасывают после центрифугирования, а супернатант используют для повторной кристаллизации. Кристаллы фосфофруктокиназы собирают центрифугированием, суспендируют в небольшом объеме Na-p-глицерофосфатного буфера, рН 7,2, содержащего 2 мМ ЭДТА, 2 мМ АТФ и сульфат аммония при 40%-ном насыщении. В этом растворе фермент хранят при 4° С.

Метод II Реактивы:

1. ЭДТА 4 мМ — 10 мМ 2-меркаптоэтанол — 30 мМ KF, рН 7,5

(раствор для гомогенизации).

2. Трис-HCl 25 мМ раствор, содержащий 30 мМ KF, рН 7,2.

3. Трис-HCl — 50 мМ раствор, рН 8,0.

KF и 2-меркаптоэтанол добавляют непосредственно перед использованием растворов. Реактивы готовят на бидистиллированной воде. Трис перекристаллизовывают из горячего С2Н5ОН. Работу проводят при 0—4° С.

Гомогенизация. Измельченную мышечную массу (с. 221) взвешивают и заливают двойным объемом (по отношению к весу) раствора для гомогенизации. Гомогенизируют в течение 45 с (гомогенизатор с металлическими ножами). Гомогенат отжимают через двойной слой марли и процесс повторяют в равном объеме того же раствора. Белковые экстракты объединяют и центрифугируют при 22 500 g в течение 20 мин. Супернатант фильтруют через стекловату.

Фракционирование (NH4)2S04 (0—40%). К экстракту медленно при постоянном перемешивании добавляют сухой {высушенный над СаСЬ), тонко растертый в ступке сульфат аммония в количестве 243 г/л. Через 30—40 мин центрифугируют (22 500 g, 15 мин) Осадок отбрасывают.

Повторное фракционирование (NH4)2S04 (40—50%). К прозрачному супернатанту добавляют сухой сульфат аммония (63 г/л) небольшими порциями с промежутками по 10 мин при постоянном перемешивании. При насыщении до 50% перемешивание продолжают в течение 45 мин, после чего суспензию центрифугируют 15 мин при 22 000g. Супернатант при отсутствии в нем ферментативной активности отбрасывают. Осадок растворяют в минимальном объеме 25 мМ трис-HCl буфера, рН 7,2, содержащего 30 мМ KF (примерно в 6 мл, если взято 400 г мышц). Суспензию центрифугируют при 22500g в течение 15 мин.

Удаление сульфата аммония. Супернатант, полученный на предыдущей стадии, пропускают через колонку (1x21,5 см), заполненную сефадексом 0-25, уравновешенную буфером 25 мМ трис-HCl — 30 мМ KF, рН 7,2 (пропускают примерно 150 мл). На колонку можно нанести 700—2500 единиц активности. Сразу после выхода раствора, соответствующего свободному объему колонки, в первых 4—5 мл содержится основная часть ферментативной активности. Эту фракцию белка выдерживают при 0—4° С в течение 2,5 ч (происходит агрегация фермента), после чего центрифугируют при 30 000g в течение 30 мин.

Концентрирование раствора белка (NH4)2S04 (0—50%). К супернатанту, полученному на предыдущей стадии, добавляют сульфат аммония до 50%-ного насыщения (313 г/л) и затем центрифугируют (22500g, 15 мин).

Осадок растворяют в 25 мМ трис-HCl — 30 мМ KF, рН 7,2 (примерно в 3 мл). Супернатант, содержащий ферментативную активность, можно хранить при 0—4° С в течение суток.

Удаление сульфата аммония. Фракцию белка, насыщенную сульфатом аммония до 50%, вновь хроматографируют на колонке в тех же условиях, как оп

страница 123
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
симисторный регулятор скорости vrs 1.5n
септопластика москва цена
кровать с подъемным механизмом массив
где можно купить дорожные сетка в москве

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(24.06.2017)