химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

и а-глицерол-3-фосфатде-гидрогеназа (по схеме I); пируваткиназа и лактатдегидрогеназа (по схеме II).

Кристаллический препарат фосфофруктокиназы растворяют в 50 мМ Na-ft-глицерофосфате, содержащем 0,2 мМ ЭДТА, 0,2 мМ ди-титреитол и 0,1 мМ АТФ, рН 8,0; концентрация фермента 2—3 ед/мл. Вместо трис-HCl буфера, рН 8,0, можно использовать трис-фосфатныщ глицилглицин-Ма-р-глицерофосфатный, триэтаноламиновый буферные растворы.

Метод I

Для определения фрукгозо-1,6-дифосфата реакционная смесь содержит систему сопрягающих ферментов, указанных на схеме I.

В спектрофотометрическую кювету вносят следующие компоненты ферментативной реакции (указаны конечные концентрации): 50мМ трис-HCl, рН 8,0, 0,1 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотреитол, 4 мМ (NH4)2S04, б мМ Mg(CH3COO)2, 1 мМ фруктозо-6-фосфат, 1 мМ АТФ, 0,2 мМ НАДН, 50 мМ КС1, альдолаза (0,4 ед/мл), триозофосфатизомераза (2,5 ед/мл) и а-глицерол-3-фосфатдегидрогеназа (0,4 ед/мл). Реакцию начинают добавлением фосфофруктокиназы. Измеряют уменьшение оптической плотности при 340 нм. Оптимизацию условий определения активности проводят, как указано на с. 208.

При расчете активности учитывают, что превращение каждого моля фруктозо-1,6-дифосфата сопровождается окислением 2 моль НАДН. Коэффициент молярного поглощения НАДН см. на с. 7.

Для определения количества образующегося фруктозо-1,б-фосфата вместо а-глицерол-3-фосфатдегидрогеназы может быть использована дегидрогеназа 3-фосфоглицеринового альдегида. В этом случае активность фосфофруктокиназы измеряют по скорости восстановления НАД+ (см. определение активности глицеральдегид-3-фосфатдегидро-геназы на с. 253).

Определение концентрации белка проводят методом Лоури (с. 81). При спектрофотометрическом определении для расчета используют коэффициент Л10/о1см=10,2 при 280 нм.

Метод II

Для определения количества АДФ (второго продукта фосфофрук-токиназной реакции) реакционная смесь содержит сопрягающие ферменты, указанные на схеме П.

В спектрофотометрическую кювету вносят следующие компоненты (указаны конечные концентрации): 50 мМ трис-HCl, рН 8,0, 0,1 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотреитол, 6 мМ Mg(CH3COO)2, 50 мМ КС1, 4 мМ (NH4)2S04, 0,2 мМ НАДН, 1 мМ фруктозо-6-фосфат, 1 мМ АТФ, 0,3 мМ фосфоенолпируват, пируваткиназу (2 ед/мл) и лактатдегидро-геназу (2 ед/мл). Реакцию начинают добавлением фосфофруктокиназы (0,005—0,015 ед/мл). Измеряют уменьшение оптической плотности при 340 нм.

Аллостерические свойства фосфофруктокиназы

Для изучения аллостерических свойств фермента используют реакционную смесь с низким значением рН (указаны конечные концентра0/1Л

ции): 25 мМ Na-p-глицерофосфат — 25 мМ гл иди л глицин, рН 7,0; 0,1 мМ ЭДТА; 0,2 мМ дитиотреитол; 50 мМ КС1; 4 мМ Mg(CH3COO)2; 0,2 мМ НАДН; 1 мМ фруктозо-6-фосфат; 1 мМ АТФ; фосфофруктокиназа и сопрягающие ферменты (см. методы I и II). Реакцию начинают добавлением фруктозо-6-фосфата. Ферменты, используемые для сопряжения, предварительно диализуют против 50 мМ трис-HCl, рН 7,5, содержащего 0,1 мМ ЭДТА и 0,1 мМ дитиотреитол.

Выделение и очистка фосфофруктокиназы из скелетных мышц кролика

Me 1 од I

Реактивы:

1. KF=30 мМ раствор, содержащий 4 мМ ЭДТА и 1 мМ дитиотреитол, рН 7,5 (раствор для экстракции).

2. Трис — 1 М раствор.

3. Ацетон (технический).

4. Сухой лед.

5. Изопропиловый спирт.

6. Трис-фосфатный буфер — 0,1 мМ раствор, рН 8,0, содержащий 0,2 мМ ЭДТА и 0,2 мМ фруктозо-1,6-дифосфат.

7. Сульфат аммония — сухой, перекристаллизованный из 5 мМ ЭДТА, рН 8,2, мелко измельченный.

8. Na-p-глицерофосфатный буфер — 50 мМ раствор, рН 7,2, содержащий 2 мМ ЭДТА и 2 мМ АТФ.

9. Na-p-глицерофосфатный буфер — 50 мМ раствор, рН 7,2, содержащий 2 мМ ЭДТА, 2 мМ АТФ, 38%-ный (NH4)2S04 (21,3г на 10 мл).

10. Na-p-глицерофосфатный буфер — 50 мМ раствор, рН 7,2, содержащий 2 мМ ЭДТА, 2 мМ АТФ, 40%-ный (NH4)2S04 (22,6 г на 100 мл).

Все растворы готовят на бидистиллированной воде. Работу проводят при 0—4° С. Трис перекристаллизовывают из горячего этилового спирта, нагревая раствор с обратным холодильником. Раствор фтористого калия приготавливают непосредственно перед употреблением.

Получение экстракта. Измельченную в мясорубке мышечную массу (см. с. 221) взвешивают и заливают двойным объемом раствора для экстракции, гомогенизируют 30 с. Массу отжимают через двойной слой марли и повторяют гомогенизацию в равном объеме того же раствора. Экстракты объединяют и центрифугируют 30 мин при 10 000g. Супернатант фильтруют через стеклянную вату и доводят рН до 6,8 добавлением 1 М триса.

Осаждение изопропиловым спиртом. Полученный экстракт помещают в сосуд с охлаждающей смесью (сухой лед — ацетон) с температурой минус 6 — минус 8° С. Экстракт охлаждают до 0°С, после чего начинают добавлять небольшими порциями при постоянном перемешивании предварительно охлажденный изопропиловый спирт (всего добавляют 1/5 объема экстракта). Температуру экстракта по мере добавления спирта понижают до —5° С (если происходит замерзание, необходимо удалить экстракт из охлаждающей смеси). После добавления всего

страница 122
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
колпаки на колеса 13 купить
привод сименс
наклейки нхл на шлем хоккейный
драконы санк питербург концерт

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(30.05.2017)